新型MR网状内皮靶向对比剂Gd-PBCA纳米微粒的合成及与SPIO在MR淋巴成像的对比研究

摘要

研究目的 一、制备Gd-DTPA聚氰基丙烯酸正丁酯纳米微粒(Gd-PBCA-NP)，并优选出最佳的制备方案； 二、在动物实验中静脉注射Gd-PBCA-NP，并与Gd-DTPA对照，考察Gd-PBCA-NP肝脏靶向强化效果，并探讨其潜在的应用价值； 三、组织间隙注射Gd-PBCA-NP，进一步评估其淋巴组织靶向增强效果，并与SPIO网状内皮阴性对比剂对比，评估两者在MR淋巴成像中对良、恶性淋巴结诊断和鉴别诊断的价值。 材料和方法 一、Gd-PBCA-NP的制备及优化 (一)制备工艺的确定 采用阴离子乳化聚合法，精密称取一定量Gd-DTPA(V/V)、Dextron-70(W/V)，溶于双蒸水中，用0.1NHCL调节PH于酸性状态，在磁力搅拌器下缓慢加入一定量PBCA单体(V/V)，搅拌4h，然后加入一定量1NNaoH调节PH于7.0，反应终止，随后用0.45um微孔滤膜过滤，将滤液存于4℃冰箱内备用。 (二)单因素初选制备条件 在一定范围内，介质的PH值、单体浓度、稳定剂及药物浓度是影响NP粒径大小及其均匀度主要因素。固定其它三种因素于某一条件下，分别考察另一因素在不同条件下对Gd-PBCA-NP粒径及其均匀度的影响。 (三)正交设计优化制备条件 在单因素初选条件的基础上，以包封率和载药量为评价指标，应用L9(34)正交表安排实验(PH值、Gd-DTPA、PBCA、Dextran-704因素，3个水平)，优化制备条件。 (四)Gd-PBCA-NP粒径及其分布的测定 用Malvern-3000HS激光粒度分析仪测定粒径及其分布：吸取5ul制备的相应样品，用双蒸水稀释至量杯中。所选激光光源波长为633.0nm，测试温度为25.00±0.05。 (五)Gd-PBCA-NP形态观察 取少量上述混合液放置透析袋(截留分子量为1,000,000Da)内，用5％葡萄糖溶液透析48h，除去游离Gd-DTPA、Dextron-70及无机离子。用透射电镜(日立H-600)观察Gd-PBCA-NP大体形态。具体操作方法为：1∶4蒸馏水稀释纯净Gd-PBCA-NP液体，取1滴放在镀膜铜网上，滤纸吸去多余液体，加入2％磷钨酸染30s，干燥后电镜下观察。 (六)Gd-PBCA-NP包封率及载药量的测定 取5ml制备的混合液按上述方法透析，透析液总量为2000ml。取20ml透析液(含游离Gd-DTPA)送交广州科学院分析测试中心，采用高频电感耦合等离子发射光谱法(ICP-AES)测定透析液中Gd离子浓度，按下式计算Gd-PBCA-NP的包封率及载药量： 包封率=(Ca-Cs)/Ca×100％载药量=(Ca-Cs)/CPBCA×100％Ca：母液Gd-DTPA浓度，Cs：透析液Gd-DTPA量CPBCA:母液PBCA浓度 二、Gd-PBCA-NP肝脏靶向性成像研究 (一)实验动物 正常清洁级Wistar大鼠18只，雌雄各半，体重167.5±18.7g，采用随机数字法将其分为三组：1、Gd-DTPA对照组：剂量为0.1mmol/kg；2、PBCA-NP组：剂量为1ml/100g；3、Gd-PBCA-NP组：剂量为1ml/100g. (二)MRI扫描方法 MRI扫描(SiemensMagnetomVisionPlus1.5T)采用头部线圈，冠状及横断面扫描，扫描参数为Turbo-SET1WI(TR/TE=500ms/15ms)和T2WI(TR/TE=2000ms/90ms)。平扫后，各组分别于注药后5min、15min、30min、1h、2h增强扫描，扫描参数同平扫。 三、组织间隙注射Gd-PBCA-NP与SPIO在MR淋巴成像中对照研究 (一)实验动物分组 健康成年新西兰白兔24只，由第一军医大学附属南方医院动物实验中心提供，体重2.0～2.5kg，采用随机法分为2组：反应性增生淋巴结组(n=12)、肿瘤转移淋巴结组(n=12)。 (二)图像评估 1、在不同序列上测量平扫、增强后腘窝淋巴结的信噪比。分别在T1WIFS、T2WI像上测量Gd-PBCA-NP、SPIO增强后反应性增生淋巴结组在各时间点的强化率。在T1WIFS像上，测量各组腘窝淋巴结的大小。观察各组增强后淋巴管形态并计算淋巴管的显示数量。 2、采用双盲法评估Gd-PBCA-NP、SPIO对诊断肿瘤转移性淋巴结的敏感性、特异性、假阳性率、假阴性率。肿瘤转移性淋巴结的具体诊断标准为：(1)Gd-PBCA-NP增强：在T1WI或T1WIFS上，与平扫相比，淋巴结信号不均匀升高或保持不变，诊断为恶性，如信号均匀升高则诊断为良性； (2)SPIO增强：在T2WI或T2*WI像上，与平扫相比，淋巴结信号不均匀降低或保持不变，诊断为恶性，如信号均匀降低则诊断为良性。 (三)病理组织学检查 所有实验动物在完成MRI增强扫描后，用放血法处死动物，仔细暴露腘窝淋巴结，摘除并测量淋巴结的短径，计算淋巴结数目。行H-E染色观察淋巴结形态和结构的变化，判别其良恶性。 结果 一、在一定范围内，Gd-PBCA-NP粒径随PBCA单体浓度的增加而增加，随PH增加而增加，随Dextran-70浓度增加而降低，Gd-DTPA浓度对Gd-PBCA-NP粒径无显著影响。 二、正交实验结果表明溶液的PH值对Gd-PBCA-NP包封率和载药量的影响最显著，Gd-DTPA浓度影响因素最小，Dextran-70浓度和PBCA浓度在选定范围内差异不明显。确定最佳制备条件为：PH值为2.5，Dextran-70浓度为1.5％，PBCA浓度为2.0％，Gd-DTPA浓度为20％。 三、透射电镜观察Gd-PBCA-NP呈类圆形，大小均匀，表面平滑完整，粒子之间无粘连，具有明显的核-壳结构。 四、激光粒度分析仪测定Gd-PBCA-NP平均粒径为65.7nm，粒径分布为0.09。五、优化制备条件下Gd-PBCA-NP的平均包封率和载药量分别为81.97％、51.23％。 六、Gd-PBCA-NP静脉注射静注后5min肝实质SNR与平扫相比无显著性差异；15min，30min，1h，2h肝实质SNR与平扫相比有显著性差异。肌肉在各时间点与平扫相比无显著性差异。静脉注射Gd-DTPA后，在第5min、10min肝脏SNR较高，而第30分钟、1h、2h同增强前肝脏SNR基本处于同一水平。PBCA-NP静脉注射后在各时间点肝实质、肌肉SNR与平扫对比无显著性差异。 七、静脉注射Gd-DTPA后5min、15min肝实质强化程度平均为35.2％、48.6％同时可见肾实质也明显强化，30min，肝实质信号强度恢复到平扫前水平。静注Gd-PBCA-NP后5min，肝实质强化程度平均为3.4％，15min、30min、1h、2h肝实质强化程度平均为22.7％，36.1％、56.4％、24.8％，与Gd-DTPA组、PBCA-NP组肝实质强化方式明显不同。 八、反应性增生淋巴结和肿瘤转移性淋巴结均制作成功，平扫两组腘窝淋巴结在各序列图像上的SNR、大小均无显著性差异，但肿瘤转移性淋巴结平均直径大于反应性增生淋巴结。 一.Gd-DTPA-NP粒径与PH值、单体浓度呈正相关，与Dextran-70浓度呈负相关。 二.优化Gd-DTPA-NP的制备条件为：PH值为2.5，Dextran-70浓度为1.5％，PBCA浓度为2.0％，Gd-DTPA浓度为20％。Gd-DTPA-NP包封率及载药量分别为81.97％、51.23％，粒径为65.7nm，大体形态呈类圆形，具有明显的核-壳结构。 三、静脉注射Gd-PBCA-NP后，在T1WI像上大鼠肝脏呈靶向性强化，说明Gd-PBCA-NP可以作为MR网状内皮细胞特异性对比剂。 四、静脉注射Gd-PBCA-NP后，大鼠肝脏最大强化幅度达56.4％，强化峰值出现在24h左右。 五、MRI平扫难以准确区分反应性增生淋巴结和肿瘤转移性淋巴结。六、与SPIO类似，Gd-PBCA-NP组织间隙注射可用来进行MRI淋巴造影。 七、组织间隙注射Gd-PBCA-NP后，反应性淋巴结最大强化峰值在24h左右，MR淋巴造影应该在24h左右比较合适。 八、组织间隙注射Gd-PBCA-NP、SPIO后，反应性淋巴结与肿瘤转移性淋巴结表现出不同的强化特征，可以用来鉴别良、恶性淋巴结。 九、与SPIO相比，Gd-PBCA-NP在鉴别良、恶性淋巴结中具有较高的准确性，而且还可清晰显示良、恶性淋巴结的引流淋巴管，可为良、恶性淋巴结的鉴别诊断提供新的指标。

目录

文摘

英文文摘

前言

第一章Gd-PBCA-NP的制备及优化

第二章Gd-PBCA-NP肝脏靶向性成像研究

第三章组织间隙注射Gd-PBCA-NP与SPIO MR淋巴成像的对照研究

附录综述脂质体MRI对比剂的研究进展

缩略语中英文对照表

攻读博士学位期间成果

致谢

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