钩端螺旋体OmpL1的表达及脑膜炎大肠杆菌IbeA单克隆抗体的制备

摘要

一、研究背景和目的 问号钩端螺旋体(Leptospirainterrogans)感染引起的钩端螺旋体病(Leptospirosis)，简称钩体病，是世界范围流行的自然疫源性的人兽共患病。由于其发病急、临床症状复杂多样且不典型，极易误诊和漏诊。所以，钩体病的实验室诊断和预防对于控制钩体病的流行具有重要的意义。Haake等1993年首次从流感伤寒群钩体基因组DNA中鉴定了一个全长963bp，编码320个氨基酸的穿膜蛋白OmpL1。用Southern杂交证实ompL1基因存在于多群问号(致病性)钩体的基因组DNA中，在非致病性钩体中检测不到，说明OmpL1是致病性钩体所特有。本文第一部分工作是建立以问号钩端螺旋体致病蛋白OmpL1为诊断抗原的检测OmpL1抗体的免疫层析技术。而黄疸出血型赖株(56601)钩体是我国独有的菌型并且具有代表性，流行范围广，毒力强。因此本实验选用我国优势流行血清群黄疽出血群赖株ompL1基因作为靶基因，采用基因工程技术获得体外高效表达的重组问号钩端螺旋体黄疽出血群赖株融合蛋白OmpL1。 细菌性脑膜炎是中枢神经系统(centralnervesystem，CNS)最常见最严重的感染性疾病。而脑膜炎大肠杆菌(Escherichiacoli，E.coli)是引起新生儿脑膜炎的主要病原体。在脑膜炎大肠杆菌的致病机理中，细菌穿过血脑屏障是致病的关键环节，但其机制尚不清楚。人的脑微血管内皮细胞(brainmicrovasculaendothelialcell，BMEC)是构成血脑屏障(blood-brainbarrier,BBB)的重要成分之一，体外分离培养的BMEC已被视为研究细菌穿过血脑屏障机理的理想模型之一。通过体内外血脑屏障模型的建立及侵袭实验，证实敲除掉ibeA基因的E.coliK1株的RS218菌的突变体不能穿入BBB，因而证明ibeA基因的编码蛋白IbeA是与细菌侵袭和致病有关的侵袭蛋白。本文第二部分的研究工作是在构建ibeA基因原核表达系统及体外表达和纯化IbeA蛋白的基础之上，制备脑膜炎大肠杆菌侵袭蛋白IbeA的单克隆抗体，为研究和探讨脑膜炎大肠杆菌K1株致病及其防治机制提供有力的工具。 二、研究方法 1、钩端螺旋体黄疸出血群赖型OmpL1蛋白的克隆、表达、纯化及鉴定利用PCR技术从问号钩体黄疸出血群赖型标准株基因组DNA中扩增出目的基因ompL1，并连接于T载体上后定向插入原核表达载体pET32a(+)中，构建表达重组质粒pET9L；经测序分析确认后，转化表达受体菌E.coliBL21(DE3)；1mMIPTG诱导表达，10％SDS-PAGE图谱分析表达情况。对包涵体洗涤后用8M尿素进行溶解，采用稀释复性的方法，并在复性液中添加还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽，使变性的蛋白得以复性。经Ni2+-NTA树脂纯化后，获得体外表达的重组问号钩体融合蛋白His-OmpL1。用SDS-PAGE和Western-blot方法鉴定重组蛋白。 1.脑膜炎大肠杆菌侵袭蛋白IbeA单克隆抗体的制备及鉴定 以重组表达的脑膜炎大肠杆菌侵袭蛋白IbeA为靶抗原与弗氏佐剂完全乳化后，免疫BALB/C小鼠，取免疫小鼠脾细胞与NS-1骨髓瘤细胞，用聚乙二醇(PEG4000)进行细胞融合，经有限稀释法进行克隆和亚克隆，获得1株能稳定分泌抗IbeA单克隆抗体的杂交瘤细胞株，定名为2C9。用Mousemonoclonalantibodyisotypingkit对单克隆抗体进行定型。利用10％Giemsa染色液对杂交瘤细胞进行染色，计算杂交瘤细胞染色体数目。经硫酸铵法提取，ProteinGSepharose4FastFlow层析柱纯化，SepharoseG25脱盐后得到纯化单克隆抗体。并用BCA总蛋白定量试剂盒检测抗体浓度。用酶联免疫吸附实验(ELISA)鉴定：①筛选阳性杂交瘤单克隆细胞株；②对阳性杂交瘤细胞培养上清及腹水单克隆抗体进行效价的测定；③以不同倍比稀释浓度的单克隆抗体与IbeA结合，计算其相对亲和力；④以脑膜炎E.coli毒力因子CglE和游离的IbeA蛋白为抑制物，对单克隆抗体进行竞争抑制实验，以检测其特异性。用Western-blot实验进一步鉴定纯化后单抗的特异性。 三、研究结果 1、用PCR扩增出大小为963bp目的基因片段ompL1，插入原核表达载体pET32a(+)，构建表达重组子pET9L；经DNA序列分析，与Genbank所登录的ompL1序列完全一致。用pET9L转化受体菌，经25℃，1mMIPTG诱导表达后，10％SDS-PAGE显示新生蛋白带，相对分子量为31-kDa，与预期一致。SDS-PAGE分析表明目的蛋白主要以包涵体形式表达，经变性和复性及Ni2+-NTA柱纯化，SDS-PAGE显示为单一条带的重组蛋白OmpL1。Western-blot显示融合蛋白His-OmpL1可被抗His单克隆抗体所特异识别。 2、获得了一株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其染色体数目为96条，该数值大于脾细胞染色体数目(40条)的2倍，小于脾细胞与瘤细胞(60-70条)的染色体数目之和，表明杂交瘤细胞确为脾细胞与瘤细胞融合而成。编号为2C9杂交瘤细胞培养上清的效价为1∶200；腹水单克隆抗体的效价为1∶12800。IbeA单克隆抗体亚型鉴定为IgG1，轻链为k链。IbeA单克隆抗体浓度为0.74mg/mL的，该抗体的相对亲和力为1.58×106L/mol。Western-blot实验显示2C9只识别IbeA蛋白，不与CglE蛋白(与IbeA蛋白的同源高达56％)反应；竞争抑制实验结果表明随着抑制物浓度降低，其对单克隆抗体与固相包被IbeA的合的抑制作用亦随之降低，上述结果均提示2C9具有良好的特异性及免疫学活性。 四、结论 1、成功构建ompL1基因原核表达载体，经体外表达获得纯化的重组蛋白OmpL1；重组蛋白具有良好的抗原性，可为进一步制备钩体病的快速诊断试剂盒提供候选抗原。 2、制备并获得一株脑膜炎大肠杆菌侵袭蛋白IbeA的单克隆抗体，该单克隆抗体具有良好的特异性和免疫学活性，为进一步探讨脑膜炎E.coli致病及其防治机制提供有力的工具。

目录

文摘

英文文摘

前言

第一章致病钩端螺旋体OmpL1的表达、纯化及鉴定

第二章脑膜炎大肠杆菌侵袭素IbeA单克隆抗体的制备及鉴定

全文总结

参考文献

缩略词表

综述 我国钩端螺旋体病部分疫区流行情况和检测方法的进展

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