鸡羽根角蛋白在体组织工程化神经——材料研制及前期实验研究

摘要

近年来，周围神经损伤的发生率趋于增高，探寻用以修复周围神经缺损并替代自体神经移植这一金标准的材料研究倍受关注。 研究发现，“神经再生小室”为神经再生提供了一个良好的、相对封闭的微环境，并能阻滞瘢痕形成。神经桥接管较好地解决了这一问题。 用来桥接周围神经缺损的材料应具备以下条件：①良好的生物相容性：材料及其降解产物对组织细胞无毒、无“三致”、无明显抗原性；②生物可降解性；③良好的表面粘附活性；④足够的生物力学性能。 国内外学者在该领域做了大量研究：从单一材料到复合材料，从非生物降解吸收材料到生物可降解吸收材料，主要包括天然材料、人工合成材料及复合材料等。这些材料在神经修复中虽取得了一定效果，但至今仍未有一种应用于临床的、产业化的神经桥接材料。 目前较受关注的是可降解吸收的天然生物材料和人工合成的高分子聚合材料。天然生物材料，即天然高分子材料或其复合物，主要指从动物结缔组织或皮肤中提取的，经特殊化学处理的，具有活性或特殊性能的蛋白质，如胶原、明胶、甲壳素、淀粉、纤维素、透明质酸等；人工合成的可降解高分子材料如聚乳酸(PLA)等，具有可标准化生产、可降解、组织相容性好等优点。但其酸性降解产物可能对周围细胞活性产生不利影响，同时其亲水性、细胞相容性、力学强度等均尚待改进。 最近我们提出“在体/原位组织工程”新概念，即：将可吸收生物支架材料植入体内，并通过材料本身和/或其降解产物活化周围组织的成体干细胞，利用体内微环境和精确的调节机制在体诱导分化和培养种子细胞，“原位”构建相应的组织或器官，从而克服了传统的体外组织工程化组织或器官构建存在的问题。我们设想以鸡羽根为材料构建在体组织工程化神经，并获得广东省自然科学基金的资助。本研究即为该项目的前期研究。 研究包括：制备可降解吸收的鸡羽根角蛋白(CCK)，观察鸡羽根角蛋白的形态结构，组织相容性及其毒性，以及生物可降解性，为鸡羽根角蛋白桥接缺损神经以及之后的产业化提供数据。 第一部分鸡羽根角蛋白的制备及形态学观察 目的 了解鸡羽根角蛋白的结构特点 方法 1.鸡羽根的获得：健康活体鸡羽，取规格类似的羽根。 2.鸡羽根角蛋白管的制备：序贯的、可控性理化处理程序。 3.形态学观察：石蜡切片HE染色、光学显微镜/扫描电镜术。 结果 1.新鲜鸡羽根：腔内有内容物，有一定的水分，较柔韧。 2.未处理鸡羽根(干燥后)：质硬，不易切断，淡黄色，半透明，内容物呈现薄膜螺旋样结构，与管腔易分离。 3.处理后鸡羽根：质柔韧，乳白色，不透明，较易切断。 4.鸡羽根显微结构：横断面，从内到外依次分为四个致密层：①嗜碱性均质状粗线(0.5～1μm宽)；②3～5层的嗜酸性角质层；③60～100层含大量色素颗粒的环行角蛋白束；④10～20层含少量色素颗粒的角蛋白束。处理前、后的鸡羽根在光镜下的结构未见明显区别。 5.鸡羽根扫描电镜观察： 未处理的鸡羽根：结构致密，管壁较平整，无孔洞。 处理后的鸡羽根：结构较疏松，角蛋白束横纵交错，可见大小、深浅不等的孔洞。 结论 1.未处理鸡羽根：天然管腔，由多层角蛋白束构成，含色素颗粒和少量基质，结构致密，不利于直接用作生物材料。 2.处理后鸡羽根：外观呈现许多孔洞，结构疏松、角蛋白束交错排列，可能为组织工程备用材料，需进一步研究。 第二部分鸡羽根角蛋白管毒性作用的观察 目的 观察鸡羽根角蛋白管的毒性作用 方法 1.鸡羽根角蛋白管浸提液的制备： 1)鸡羽根角蛋白管的制备：采用序贯的、可控性理化程序不同程度(轻、中、重)的处理，制备相应的羽根角蛋白管。 2)浸提液制备：将上述3种羽根角蛋白管按每6cm2表面积分别加入9％氯化钠注射液或MEM培养基lml，37℃下浸泡72h，即得浸提液。 2.浸提液化学特性：Lowry's法测定蛋白质和肽类物质总量；紫外吸收法测定其280nm和254nm处的光吸收及其比值；改良的Γабризлян紫外吸收法测定中分子肽含量；Ellman法测定巯基含量。 3.皮肤致敏实验：将2cm×2cm规格的滤纸分别浸泡在3种鸡羽根角蛋白浸提液(实验组，n=6)、9％氯化钠注射液(阴性对照，n=6)及甲醛溶液(阳性对照，n=6)中浸透后待用。分别贴于SD大鼠背部脱毛皮肤，6h后移去滤纸，24h和48h后观察实验部位的情况。每周重复一次，连续3周。 4.皮内刺激实验：家兔脊柱两侧皮下分别注射3种鸡羽根角蛋白浸提液(实验组，n=5点)、9％氯化钠注射液(对照组，n=5点)，24h、48h、72h后观察局部组织反应。 5.小鼠全身急性毒性实验：昆明小鼠腹腔内分别注射(50ml/kg)3种鸡羽根角蛋白浸提液(实验组，n=5)和9％氯化钠注射液(对照组，n=5)，4、24、48、72h时观察动物的一般状况、毒性表现和死亡数。 6.细胞毒性实验：在96孔L929细胞培板内分别加入3种鸡羽根角蛋白的培养基浸提液(实验组，n=8)和MEM培养液(对照组，n=8)，于2，4，6d时观察细胞情况(MTT法)。 结果 1.9％氯化钠注射液为浸提介质的浸提液外观变化不明显，MEM培养基为浸提介质的浸提液外观上由红色变为粉红色，pH值波动不大。 2.鸡羽根浸出液中释放物质主要成份为中等分子量的肽类物质，大分子蛋白释放不多。 3.皮肤致敏实验：皮肤无红斑、水肿和坏死。 4.皮内刺激实验：皮内无红斑水肿现象。 5.小鼠全身急性毒性实验：未出现死亡、衰竭、发绀、震颤、严重的腹部刺激、眼睑下垂，呼吸困难等毒性、症状。 6.细胞毒性实验：细胞毒性接近于0级。 结论鸡羽根角蛋白管可被水解，释放一些肽类物质，其浸提液对皮肤无致敏作用，皮内刺激反应弱，不引起全身急性毒性症状，无细胞毒性。 第三部分鸡羽根角蛋白植入后的形态学观察 目的 观察鸡羽根角蛋白在活体组织内的降解及其对周围组织的影响 方法 1.SD大鼠背部肌组织内分别植入鸡羽根角蛋白片(轻、中、重)(实验组，n=6)和未处理羽根片(对照组，n=6)，1w、4w、8w、12w时取材(含周围组织)，常规组织切片染色，光镜下形态学观察； 2.SD大鼠坐骨神经束间分别植入鸡羽根角蛋白丝(轻、中、重)(实验组，n=6)和未处理羽根丝(对照组，n=6)，3w、8w时取材，常规组织切片染色，光镜下形态学观察，冰冻切片行Nestin免疫组化观察。 结果 1.不论肌组织内植入还是神经束间植入，实验动物都未出现死亡现象。 2.形态学观察： 1）肌组织内植入：1w包膜形成，分界清，可见大量炎性细胞浸润；4w材料呈条丝状劈开，仍有炎性细胞；8w材料呈细丝状或散在细颗粒状，进一步降解吸收，仍有少量炎性细胞，可见多核巨细胞；12w材料降解显著，材料被分成细小的碎片。对照组各时间段材料结构完整。 2)神经束间植入：3w、8w引起的组织反应与细胞类型同肌组织内植入，均未完全降解，实验组材料对神经纤维无不良影响，而对照组神经纤维出现自溶现象。Nestin免疫组化未检测到阳性结果。 结论 1.鸡羽根角蛋白管体内可降解，其降解产物不引起机体组织的变性、坏死。 2.其组织相容性尚不理想，需进一步改良和优化处理程序。 创新之处 1.目前还未见到鸡羽根角蛋白被用于医学领域的报道。 2.初步观察了鸡羽根的结构特点，探讨了鸡羽根角蛋白的制备，不同处理等级的鸡羽根角蛋白管的生物相容性和安全性。

目录

文摘

英文文摘

第一部分鸡羽根角蛋白的制备及形态学观察

第二部分鸡羽根角蛋白管的毒性作用的观察

第三部分鸡羽根角蛋白植入后的形态学观察

全文总结

附录

攻读学位期间成果

致谢

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