外源性人胰岛素样生长因子Ⅰ基因在人关节软骨细胞中的表达及对其增殖影响的实验研究

摘要

外伤或退变等疾患引起的关节软骨损伤在临床上很常见，但软骨组织中不具有血管与神经，其损伤后不易自我修复。对于关节软骨损伤的修复在目前的骨科临床、基础研究中仍是一个重要的课题。许多研究表明，生物活性因子在关节软骨的损伤、修复机制中，起着重要的调节作用。某些生长因子如胰岛素样生长因子(IGF)可刺激软骨细胞分化的表型。表皮生长因子(EGF)具有很强的促有丝分裂和刺激合成代谢的作用。通过细胞生长因子的调控，在体外可以促进软骨细胞的分裂增殖，尽管通过这些因子对体外培养的软骨细胞进行作用，促进了软骨细胞的分裂增殖，但机体对软骨细胞作用的内环境是多种因子相互作用、相互调节的结果。局部应用生长因子时，有效成分容易被稀释或在机体对软骨细胞作用的内环境中丢失。 IGF-Ⅰ是一种由70个氨基酸组成的多肽，分子量为7.6kDa，其结构与胰岛素同源，受生长激素调节。它是第一个被确认对关节软骨具有自分泌调节作用的生长因子，在关节软骨中的作用有：(1)刺激细胞分裂增殖。IGF-Ⅰ显著促进多种来源的软骨细胞增殖，而不影响软骨细胞的分化状态。(2)促进蛋白多糖的合成，阻止基质金属蛋白酶的表达，减慢蛋白多糖的降解。体外研究发现，在白介素-1β和肿瘤坏死因子存在的条件下，IGF-Ⅰ仍能促进软骨细胞的蛋白多糖合成。(3)刺激Ⅱ型胶原蛋白的合成。在无血清的体外培养中，IGF-Ⅰ能显著刺激Ⅱ型胶原蛋白的合成。无论对于未成熟或者己分化成熟的软骨细胞，IGF-Ⅰ在促进软骨细胞合成代谢方面的作用是相似的，在生长发育期间，刺激关节表面的增大；在肢端肥大症患者，组织中IGF-Ⅰ水平增高可引起成人关节软骨的肥大和增生。 应用IGF-Ⅰ软骨细胞联合移植能促进缺损软骨的修复，但外源性IGF-Ⅰ半衰期短，需大剂量反复使用，而且价格昂贵。研究表明，利用转基因技术将生长因子基因转入种子细胞后可在局部缺损区持续高表达具有生物活性的内源性生长因子，调控其自身的增殖与分化。将含有IGF-Ⅰ基因的腺病毒载体直接注射到兔膝关节腔内，关节灌洗液中IGF-Ⅰ的表达水平明显升高，但这种在体基因转染方式不能确定基因是否转染软骨细胞，更不能确定转基因细胞的生物学作用。将IGF-Ⅰ基因转入人软骨细胞，体外研究比较转基因软骨细胞的生物学行为，再将转基因细胞移植体内，更能为软骨组织工程的研究提供可靠的实验依据。在本实验中，我们利用重组腺病毒将IGF-Ⅰ基因转染入人软骨细胞中，对IGF-Ⅰ转移入人软骨细胞的可行性和IGF-I对软骨细胞增殖的影响进行了初步的探讨。 第一部分：Ad-hIGF-Ⅰ的构建和鉴定 目的：构建、鉴定Ad-hIGF-Ⅰ。方法：①构建Ad-hIGF-Ⅰ：PCR合成hIGF-Ⅰ基因，用pMD18-T载体克隆hIGF-Ⅰ目的基因，酶切、测序并进行NCBIBLAST分析。将pMD18-ThIGF-Ⅰ和pDNR-Ir质粒合成中间载体pDNR-hIGF-Ⅰ，酶切鉴定。Cre-loxP系统介导pDNR-hIGF-Ⅰ和plnt.AVI.SpaT同源重组形成plnt.AV1.SpaT-hIGF-Ⅰ重组表达质粒，EcoRⅠ酶切鉴定。复苏293细胞，将plnt.AVI.SpaThIGF-Ⅰ和pInt.B.B质粒在293细胞内进行同源重组成Ad-hIGF-Ⅰ.②鉴定Ad-hIGF-Ⅰ，倒置显微镜观察293细胞病变样效应(cytopathogenicefect，CPE)；Ad-hIGF-Ⅰ进行PCR鉴定。用半数组织培养感染法测定第3代重组腺病毒滴度。结果：克隆的hIGF-Ⅰ基因证实与基因库中序列完全相同。转染293细胞12-14d后，大部分细胞出现肿胀，脱落等CPE现象。PCR鉴定重组Ad-hIGF-Ⅰ含有hlGF-Ⅰ目的基因。第3代重组腺病毒滴度为70×109PFU/L。结论：成功构建出Ad-hIGF-Ⅰ。获得大量高滴度的重组腺病毒。 第二部分：IGF-Ⅰ基因转染人关节软骨细胞及其在软骨细胞中的表达 目的：探讨IGF-Ⅰ基因转染人关节软骨细胞的可能性及其在软骨细胞中的表达，初步判断转基因细胞的生物学功能变化。方法：将收集好的Ad-hIGF-Ⅰ转染人关节软骨细胞，分别转染1，10，100及500不同感染复数单位(multiplicityofinfection，MOI)的Ad-hIGF-Ⅰ，用PBS做阴性对照，采用MTT法检测不同时间、不同组别软骨细胞吸光度。用SPSS10.0统计分析实验数据。通过RT-PCR和ELISA方法检测IGF-Ⅰ基因在人关节软骨细胞中的表达；分别收集同代软骨细胞与转基因细胞，测各瓶细胞DNA量。收集细胞周围基质，测基质中葡萄糖醛酸含量，免疫细胞化学检测Ⅱ型胶原的表达。用流式细胞仪检测细胞G1、S、G2时相所占百分比。结果：不同病毒滴度转染对软骨细胞吸光度的影响存在量效、时效依赖关系，100MOI软骨细胞吸光度约为PBS组的3倍；72h达到峰值。在0-100MOI范围内，随着病毒滴度增加。Ad-hIGF-Ⅰ转染软骨细胞后，转染组和对照组的生长曲线均为S形。第2天起，转染组细胞数均较对照组高。转染组的对数生长期从第2天开始，比对照组提前一天。实验组DNA含量均高于对照组。糖醛酸是PG的重要组成部分，又是重要的分解代谢产物。检测糖醛酸含量间接反映基质中PG的含量。随着软骨细胞增殖，基质中糖醛酸含量明显增加，4天后趋于稳定，实验组糖醛酸含量均高于对照组。RT-PCR能见到298bp的阳性条带；ELISA检测培养液中分泌的IGF-Ⅰ蛋白，显示转染后第2天即明显升高，第6天胰岛素样生长因子达分泌高峰，此后渐下降，于第12天仍显著于转染前(p＜0.05)。免疫细胞化学检测显示转染后的软骨细胞仍高表达Ⅱ型胶原。实验组细胞周期的S期比例增加，G1期和G2期比例减少。结论：Ad-hIGF-Ⅰ转染对软骨细胞增殖的影响存在量效、时效依赖关系。IGF-Ⅰ基因转染人关节软骨细胞后能在软骨细胞中表达，并能促进软骨细胞分泌软骨基质PG，刺激软骨细胞合成Ⅱ型胶原，来维持软骨细胞的表型。

目录

文摘

英文文摘

前言

第一章hIGf-I基因腺病毒载体的构建、包装与扩增

第二章hIGf-I基因在软骨细胞中的表达及对其增殖的影响

结论

参考文献

英文缩写词表

文献综述 关节软骨缺损修复的研究进展

攻读博士学位期间成果

致谢

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