p38丝裂原活化蛋白激酶在蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛中作用的实验研究

摘要

脑血管痉挛(cerebrovascularvasospasmCVS)是动脉瘤性蛛网膜下腔出血(subarachnoidhemorrhageSAH)后最常见的并发症之一，它的高致死率(15～20％)、致残率(约50％)严重威胁到人类的健康。CVS通常分为两种：一是SAH后破入蛛网膜下腔中的血液对脑血管的机械性刺激作用所致的暂时性或早发性CVS。这种早发性CVS在动物实验中常可见到，但在人类证据尚不充分；二是出血数天后发生、持续时间较长的迟发性CVS(delayedcerebrovascularvasospasmDCV)。DCV是临床上最常见的CVS，一旦发生，往往难以逆转，对血管扩张剂的反应较差，导致进一步的缺血性脑损害。CVS的治疗缺乏十分有效的方法，原因在于致病机理迄今尚未明了。目前研究认为SAH后血凝块的一些分解产物，如血红蛋白(Hb)、内皮素(ET)、凝血酶(thrombi)、5-羟色胺(5-HT)等能引起脑血管收缩，但并不能完全解释CVS的致病机制。近几年来研究发现，平滑肌细胞收缩调节的信号转导机制(signaltransductionpathways)可能会诱导CVS的发生。此机制主要通过三个途径诱导平滑肌的收缩运动：①肌球蛋白轻链激酶(myosinlightchainkinaseMLCK)途径②蛋白激酶C(proteinkinaseCPKC)途径③促丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinaseMAPK)途径。其中MLCK途径在多个实验性研究中被证实参与了SAH后早发性CVS的形成，而PKC途径是否在CVS中起作用存在争论。MAPK途径目前处于实验研究阶段，相关报道甚少。p38是MAPK家族成员之一，目前明确在各种生命活动中发挥广泛而重要的作用，包括：①调节细胞的增生②调节细胞的调亡③调节基因表达④诱导致炎细胞因子的产生。本研究针对p38的生物功效，通过两个方面探讨p38MAPK在CVS中的作用。 第一部分初步探讨p38MAPK在CVS中的作用 研究目的是研究p38MAPK在兔二次注血模型后痉挛的基底动脉平滑肌细胞中的表达与基底动脉变化规律的关系，初步探讨p38MAPK在脑血管痉挛形成机制中的作用。35只雌性新西兰白兔，体重2.8～3.0Kg，随机分为：对照组(N=5)，SAH组(N=10)、SAH+DMSO(N=10)、SAH+SB203580组(N=10)。其中SAH组、SAH+DMSO组、SAH+SB203580组每组又分别按照在首次注血后day5、day7活体灌注处死进行对照而分为2个小组(n=5)。采用枕大池二次注血的方法建立SAH模型，即在day0和day2时分别经枕大池两次注射自体动脉血(0.5ml/Kg)。从day3开始，SAH+DMSO、SAH+SB203580两组动物，枕大池内分别注入干预药物DMSO、p38MAPK特异性抑制剂SB203580，持续到各组处死前一天。动物处死采用活体经左心室灌注10％的缓冲中性甲醛。处死后，立即开颅取含有基底动脉全长的脑干及脑组织，置于10％的中性甲醛中保存、固定。固定后的基底动脉先用石蜡包埋，在每个血管的近、中、远段的中点取材，每点连续取3个4μm的切片，切片用于HE染色和免疫组织化学检查。采用同济医科大学高分辨医学图像分析系统(HMIAP-2000)测量血管周长和观察p38MAPK阳性表达情况。血管横截面积根据数学公式：半径=周长/2π、面积=π×半径2计算得出；而p38MAPK阳性表达的量化分析采用文献报道的一个量化评分表计算得出。方差分析(One-wayANOVA，LSD)和非参数检验(Mann-WhitneyU)两种统计方法用于数据统计分析。 HE染色：对照组动物的基底动脉HE染色显示组织结构正常，基底动脉外膜胶原纤维较薄。在day5，SAH组、SAH+DMSO组出现管径狭窄、内膜出现明显皱褶、平滑肌细胞肥大、坏死、扭曲变形，外膜胶原纤维明显增多变厚且有粒细胞和单核细胞浸润；而在SAH+SB203580组基底动脉管径出现的一系列变化基本恢复：内皮恢复平滑，只出现少量破损；平滑肌层细胞间隙基本恢复、外膜炎性反应基本消失、胶原纤维增生明显缓解。在day7，所有实验组动物基底动脉基本趋于正常。 免疫组织化学：p38MAPK在内皮细胞和平滑肌细胞中表达，定位于胞膜和胞浆。对照组动物基底动脉p38MAPK免疫反应轻微，几乎没有出现(量化评分为0)。SAH后day5，p38MAPK在SAH组、SAH+DMSO组动物基底动脉上的表达强烈(量化评分分别是2、1.80)，主要反应在平滑肌细胞上，与对照组有明显差异(P＜0.01)。而SAH+SB203580组动物基底动脉上p38MAPK的免疫反应明显减弱(量化评分为0.20)与对照组相比无明显差异(P＞0.05)，但与SAH组、SAH+DMSO组相比有统计学意义(P＜0.01)。在day7，实验组动物基底动脉平滑肌层p38MAPK表达与对照组无明显差异(P＞0.05)。 以上结果显示：兔枕大池二次注血模型基底动脉在注血后day5时出现明显的形态学改变：包括动脉管腔狭窄、内皮细胞损伤、平滑肌细胞肥大及外膜胶原纤维增生、炎症细胞浸润等病理改变与文献报道人类SAH痉挛动脉类似。免疫组织化学的研究显示：兔基底动脉注血后day5，基底动脉出现明显收缩的同时p38MAPK在平滑肌细胞上表达显著增强；而在注血后day7两者恢复到注血前水平，表明p38MAPK表达增强程度的变化与注血后CVS程度随着时间的变化一致。应用p38MAPK特异性抑制剂后，兔基底动脉形态学的改变不明显，与对照组相似。平滑肌的收缩显著缓解，同时p38MAPK的表达也明显减轻。这些结果提示p38MAPK信号转导通路的激活可能是迟发性CVS发生发展的重要机制。 第二部分p38MAPK诱导的致炎细胞因子TNF-α在CVS中的作用 炎症免疫反应与CVS的关系密切，而诱导致炎细胞因子生成是p38MAPK一个重要的生物效应。前面的实验结果提示了激活的p38MAPK在迟发性CVS中的重要作用，本研究的目的就是进一步的探讨由p38MAPK诱导的致炎细胞因子在CVS发生、发展中的作用。30只雌性新西兰白兔，体重2.8～3.0Kg，随机分为5组：①对照组；②SAH-day3组③SAH-day5组④SAH+DMSO组⑤SAH+SB203580组。采用枕大池二次注血的方法建立SAH模型。每只动物在首次注血前和处死前行枕大池穿刺留取脑脊液1ml，以1500r/min的速度在离心机上离心15min，取上清，立即-80℃低温保存。从day3开始，SAH+DMSO、SAH+SB203580两组动物，枕大池内分别注入干预药物DMSO、p38MAPK特异性抑制剂SB203580，持续到各组处死前一天。动物处死采用活体经左心室灌注10％的缓冲中性甲醛。处死后，立即开颅取含有基底动脉全长的脑干及脑组织，置于10％的中性甲醛中保存、固定。固定后的基底动脉先用石蜡包埋，在每个血管的近、中、远段的中点取材，每点连续取3个4μm的切片，切片用于HE染色和免疫组织化学检查。采用同济医科大学高分辨医学图像分析系统(HMIAP-2000)测量血管周长和观察p38MAPK阳性表达情况。血管横截面积根据数学公式：半径=周长/2π、面积=π×半径2计算得出；而p38MAPK阳性表达的量化分析采用文献报道的一个量化评分表计算得出。脑脊液中的TNF-α浓度采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定。方差分析(One-wayANOVA，LSD)、非参数检验(Mann-WhitneyU)、pearson相关性分析统计方法用于数据统计分析。 以上结果显示：在兔枕大池二次注血模型中，基底动脉收缩的同时平滑肌细胞p38MAPK激活并持续高表达，而外周脑脊液中的致炎细胞因子TNF-α浓度明显升高并保持稳定；应用抑制剂干预后，痉挛的基底动脉明显缓解，平滑肌细胞p38MAPK表达不明显，而外围脑脊液中的致炎细胞因子TNF-α浓度显著降低。pearson相关性分析显示TNF-α浓度的变化与基底动脉横截面积的变化呈负相关性(Pearson相关系数r=-0.812，P=0.000)。提示由CVS的形成可能不是p38MAPK的直接作用的结果，而是与其所诱导的炎症反应密切相关。 结论 1、本研究系统观察了兔二次枕大池注血模型后，痉挛基底动脉平滑肌细胞p38MAPK的表达的变化规律，发现p38MAPK的激活和过度表达是引起CVS的主要原因。 2、观察到二次注血后，兔脑脊液中致炎细胞因子TNF-α浓度变化的规律，发现TNF-α浓度的变化与兔基底动脉横截面积的变化呈明显的相关性，提出CVS可能是p38MAPK通过激活各种产细胞因子途径，从而对细胞因子起到一个增量调节的结果，最终导致了血管平滑肌持续性的收缩的新理论。 3、观察到p38MAPK特异性抑制剂SB203580能够通过阻断p38MAPK激活途径实现防治CVS的作用机理，为临床治疗提供了新的理论依据。

目录

文摘

英文文摘

第一章 p38MAPK对蛛网膜下腔出血后迟发性脑血管痉挛的影响

第二章 p38MAPK诱导的致炎细胞因子在迟发性脑血管痉挛中的作用

攻读硕士学位期间的成果

附录 英文缩写表

综述（一）MAP激酶在脑血管痉挛中作用的研究进展

综述（二）蛛网膜下腔出血（SAH）活体动物模型的研究进展

致谢

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