HP-Herceptin光敏免疫偶联物的制备及体外光敏免疫效应的研究

摘要

目的 研究光敏免疫偶联物血卟啉-赫赛汀(HP-Herceptin)的双重导向作用，体外作用于人乳腺癌细胞，对肿瘤细胞的杀伤效果进行检测并对其抗肿瘤效果进行评价，以期提高光动力治疗的靶向性，寻求更为有效的光免疫临床治疗方法。 方法 1、对人乳腺癌细胞BT-474肿瘤细胞株进行传代培养，并用流式细胞术测定其细胞表面HER-2表达率； 2、用碳二亚胺(EDCI)作为缩合剂，将光敏剂血卟啉与单克隆抗体Herceptin偶联，对HP-Herceptin偶联物进行透析、凝胶过滤纯化。 3、用薄层层析法、紫外分光光度计法，红细胞溶血试验ELISA法对偶联物进行定性及定量。 4、用MTT法测定HP-Herceptin体外对BT-474细胞的杀伤作用。 5、用FCM法测定HP-Herceptin体外对BT-474细胞的杀伤及凋亡作用。 [结果] 1、BT-474细胞经过复苏、传代培养后，生长状态良好，细胞成团块生长，单个细胞体积大，圆型透亮。流式细胞术(本院血液科实验室)测定BT-474细胞表面HER-2表达率为99.42％。 2、HP与Herceptin经过偶联后，经过PBS液透析，装柱于G-25葡萄糖凝胶柱洗脱，收集暗红色第一峰。 3、薄层层析结果：纯化后的产物呈暗红色，用薄层层析对HP、赫赛汀及偶联物进行层析，紫外灯下观察，可见游离HP被展开，而偶联物依然在点样位置，二者均有荧光，结果表明HP和Herceptin偶联成功。 4、紫外分光光度计法：测得HP最大吸收波长367.5nm为测定波长。HP溶液(0.001％PBS液为溶剂)的浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，得回归方程：Y=0.2136X-0.1206(R2=0.9991)，结果表明HP在1～9μg/ml浓度范围内线性关系良好。同法配制赫赛汀溶液，测得其最大吸收波长是263.7nm。得回归方程：Y=2.1274X+0.0052(R2=0.9992)，结果表明赫赛汀在0.022～0.11mg/ml浓度范围内线性关系良好。由一定浓度的血卟啉在263.7nm处的吸光值，根据Beer定律A=ECL，可计算出血卟啉在263.7nm处的吸光系数E值。运用双波长法计算偶联物中HP及赫赛汀含量，并按公式计算偶联物中HP和赫赛汀的摩尔比：238∶1。 5、HP-Herceptin偶联物和Herceptin与SK-BR-3膜浆抗原(Her-2表达的P185蛋白)免疫活性测定结果显示：抗体浓度从起始浓度75-0.58μg/ml8级倍比稀释，抗体此浓度范围内相对应的HerceptinA492值为0.786～0.096；偶联物的A492值为0.833～0.154。经统计学Pearson相关分析，两组曲线浓度与吸光度相关度好，呈正相关关系，r=0.99(p=0.000)。两条曲线基本重合，说明HP-Herceptin偶联物的免疫活性较偶联前的Herceptin并无明显改变。 6、MTT法，在HP剂量相同的情况下，Hp-赫赛汀偶联物对BT-474细胞的杀伤效果明显优于游离HP及单纯赫赛汀组，各组差异有统计学意义(p=0.018)。显微镜下观察，细胞的形态变化也证明了此结果，并且随着药物浓度的增加，细胞死亡率增加。 7、用FCM法测得偶联物组的杀伤作用和MTT法所测一致，明显高于游离HP组及赫赛汀单抗组(P=0.000)总体凋亡率总体凋亡率三组平均依次为74.87％±4.36、64.15％±4.01和22.37％±4.70，也明显高于游离HP组(p=0.008)及赫赛汀单抗组(P=0.000)多重比较后有统计学意义。由些结果显示：在体外，偶联物对细胞的杀伤及凋亡作用明显优于其它实验组。 结论 1、购自于北京协和医科大学基础研究室的BT-474肿瘤细胞株的HER-2表达率符合实验设计要求，可以用于本实验。 2、用碳二亚胺法进行偶联成功，用紫外分光光度计法分别计算出偶联物中血卟啉、Herceptin的浓度，并用ELISA法测得偶联物免疫活性与偶联前比无明显差异，能够保持原有活性。用溶血试验检测HP药效无改变。 3、HP-Herceptin偶联物对HER-2表达阳性的肿瘤细胞的杀伤作用及诱导凋亡作用较单纯血卟啉、Herceptin明显增强。存在进一步光免疫治疗的实验基础。

目录

文摘

英文文摘

前言

第一部分BT-474细胞株的培养及HER-2表达鉴定

第二部分HP-Herceptin光敏免疫偶联物的制备及表征

第三部分、HP-Herceptin偶联物免疫活性的测定

第四部HP-Herceptin偶联物体外抗肿瘤细胞活性的检测

参考文献

肿瘤光动力治疗（综述）

中英文对照缩略词表

附录 攻读硕士学位期间署名为第一作者发表的学术及参加学术会议

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