假肥大型肌营养不良症基因缺失连接片段的克隆和应用

摘要

假肥大型肌营养不良症(pseudohypertrophicmusculardystrophy，PMD)是一种常见的致死性X-连锁隐性遗传病，病因主要是由于X染色体短臂2区1带(Xp21)的基因突变而导致一种细胞骨架蛋白——抗肌萎缩蛋白(dystrophin)的结构和功能异常所致。根据dystrophin空间结构改变和功能丧失程度不同，PMD可分为Duchenne型肌营养不良(Duchennemusculardystrophy，DMD)和Becker型肌营养不良(Beckermusculardystrophy，BMD)两型，其中DMD是最常见的类型，发病率约为1/3500活产男婴。 dystrophin基因全长超过2500kb，是迄今为止发现的人类最大基因，其突变发生率高，形式多样。大片段基因缺失是dystrophin基因最常见的突变类型，约占55～65％，是导致DMD/BMD的主要原因。dystrophin基因缺失的机制至今仍未完全阐明，目前对dystrophin基因缺失机制的研究主要采用两种方法：一是缺失断裂点分布特点的研究，二是缺失连接片段序列特点的研究。 由于分析dystrophin基因缺失连接片段的序列特点需要对其进行克隆和测序，而dystrophin基因甚为庞大，一直以来克隆缺失连接片段的方法都很复杂，因此目前有关缺失连接片段的序列资料比较缺乏，迄今国内外文献仅报告50余例缺失连接片段的序列资料。试图以如此有限的资料阐述dystrophin基因缺失机制无疑是困难的，当前研究者们仅有的共识是同源重组不是大多数dystrophin基因缺失的原因，除此之外的各种假设往往互不相同甚至部分互相矛盾，具有很大的争议。 为了更多了解dystrophin基因缺失连接片段序列特点，我们的研究从克隆2例DMD/BMD病例的缺失连接片段出发，在实验技术上在国内首次采用PCR步移法对内含子上的断裂点进行定位，然后直接以PCR法扩增缺失连接片段。通过采用分次PCR步移法，初步探讨在dystrophin基因大内含子上准确定位断裂点的策略；通过对2例缺失连接片段的克隆和测序，探讨2例缺失连接片段断裂点局部的分子结构特点；随后我们对这2例缺失连接片段和以往国内外文献公开报道的55例有效缺失连接片段的序列资料进行综合分析，探讨重复序列、基质附着区(matrixattachmentregions，MARs)、TTTAAA序列以及基因缺失后修复方式等因素在dystrophin基因缺失中的作用，以深入阐述dystrophin基因缺失的机制。 同时基于目前DMD/BMD的携带者检测和产前诊断技术尚不成熟，国内外均未常规开展这方面的工作的现状，我们在进一步完成1个BMD家系中6例患者/或携带者的基因缺失连接片段的克隆和测序分析后，对本项研究在携带者检测和产前诊断上的应用价值进行了初步探讨。 材料和方法 1.定位dystrophin基因缺失断裂点的策略 选择2例临床证实的男性DMD/BMD患者(例1为DMD散发病例，例2为一BMD家系先证者)，常规蛋白酶K和苯酚法抽提制备其外周血基因组DNA。通过18+8对外显子引物PCR反应检测证实例1患者为dystrophin基因第45～54外显子缺失，例2患者为第3～5外显子缺失。 2例5'端断裂点分别位于dystrophin基因庞大的第44和第2内含子，在以上2个大内含子上先各设计5对引物将内含子序列人为地分成长度大致均等的6个待查区域，经第一次PCR反应检测确认断裂点所在区域后继续在该区域每3kb序列设计1对引物。2例3'端断裂点分别位于第54和第5内含子，引物设计为直接每3kb序列设计1对引物。PCR步移法检测中若相邻2对内含子引物1对扩增为正常阳性结果而另1对扩增为阴性结果，即可判断内含子上断裂点的近似位置。 2.dystrophin基因缺失连接片段的克隆和测序 在对2例dystrophin基因缺失断裂点准确定位的基础上，分别在靠近例1患者第44和第54内含子断裂点处和例2患者第2和第5内含子断裂点处各设计1对配对引物，以直接对2例缺失连接片段进行长片段PCR扩增，扩增成功的PCR产物纯化后测序。 将所测序列和正常内含子序列进行对比，分析2例缺失连接片段5'端和3'端断裂点两侧各100bp序列的分子结构特点。内含子重复序列的分析采用RepeatMasker程序http：//www.repeatmasker.org/cgi-bin/WEBRepeatMasker，MARs分析采用MAR-Wiz程序http：//www.futuresoft.org/MAR-Wiz。 3.57例缺失连接片段序列特点的分析 通过Pubmed文献检索获取既往共55例有效的缺失连接片段序列资料，结合本研究克隆的2例缺失连接片段作综合分析，对上述57例缺失连接片段5'端和3'端断裂点两侧的序列进行重复序列、MARs、TTTAAA序列以及基因缺失后修复方式的分析。 4.利用缺失连接片段对一缺失型BMD家系的携带者进行基因诊断 选择例2BMD患者家系为研究对象，家系中先证者a已经证实为dystrophin基因第3～5外显子缺失并已克隆其缺失连接片段(JUNCTION2)，可能携带者b为先证者a的妹妹，患者c为先证者a的弟弟，肯定携带者d为a、b、c的母亲，可能携带者e为患者c的女儿，以及可能携带者b人流后的绒毛f，常规蛋白酶K和苯酚法抽提制备本家系基因组DNA共6份。 以克隆和测序JUNCTION2的引物对本家系可能的缺失连接片段进行PCR扩增和测序。以扩增SRY基因的引物对绒毛作性别诊断。

目录

文摘

英文文摘

第1章前言

第2章定位dystrophin基因缺失断裂点的策略

第3章dystrophin基因缺失连接片段的克隆和测序

第4章dystrophin基因缺失机制的探讨

第5章携带者检测和产前诊断的一种新方法

第6章小结

附录

攻读硕士学位期间发表的论文

致谢

第一军医大学学位论文原创性声明及版权使用授权书