腺病毒介导VEGF基因和eGFP基因共转染hBMSc对其体外增殖分化影响的实验研究

摘要

目的 (1)体外构建血管内皮生长因子VEGF165基因腺病毒载体。 (2)对人骨髓基质干细胞(hBMSc)进行体外培养及扩增，观察其原代及传代细胞的生长特点及生物学特点。 (3)将VEGF165基因腺病毒载体共转染hBMSc，观察其表达。 (4)观察转染对hBMSc增殖、分化的影响。(5)观察eGFP示踪转染效率及VEGF165的表达。 方法 (1)通过PCR方法人工合成VEGFV65的cDNA序列。合成完整的基因序列，测序。合成的VEGF165两端带有EcoRⅠ和BamHⅠ位点，并克隆到pMD18-T载体中，对pMD18-T-VEGF165进行双酶切。把含有pDNR质粒(含eGFP基因)的菌液接种到LB培养基，用试剂盒提质粒，得到的质粒进行EcoRI和BamHI的双酶切。回收5.6Kb左右的片段，与合成的带有EcoRⅠ和BamHⅠ位点的VEGF165连接，过夜连接，转化感受态细胞，挑选单克隆，鉴定，构建pDNR-VEGF165载体。通过Cre-loxP系统介导与pDNR-VEGF165之间的重组。pInt.AV1.spat与pDNR-VEGF165共转化BNN菌株的感受态细胞，在细菌内实现重组。挑选单克隆，进行酶切鉴定，构建pInt.AV1.sPAT.VEGF165腺病毒表达载体。复苏并扩增293细胞。 (2)骨髓取自早产死胎采用全骨髓法进行培养扩增，传代后改用含地塞米松(10-8mol/L)、B-甘油磷酸钠(10mmol/L)和维生C(50mg/L)的条件培养基促使其向成骨细胞定向诱导分化。 (3)实验分为三组：①VEGF185和eGFP基因转染hBMSc组；②空腺病毒载体转染hBMSc组；③单纯hBMSc组。相差显微镜和光镜下进行HE染色组织学观察细胞生长形态变化。将传至第2代培养的细胞各以0.5×104/孔，接种于24孔板中，次日起选择4个复孔细胞，分别于接种后2、4、6、8d进行MTT检测。 结果 (1)通过PCR技术合成VEGF165基因，合成的VEGF165基因克隆到PMD18-T载体，经测序验证，所克隆的VEGF165序列在NCBIBLAST进行相似性在线分析，发现与报道的Homosapiensvascularendothelialgrowthfactor(VEGF)(VEGF165，NM_001025368gi：71051580)的序列完全相同。进行PMD18-T载体扩增。合成的VEGF165两端带有EcoRⅠ和BamHⅠ位点，并克隆到2.7Kb的pMD18-T载体中，对pMD18-T-VEGF165进行双酶切。电泳结果可见，600bp的VEGF165基因已经插入到2.7Kb的pMD18-T载体中。提取pInt.AV1.sPAT.VEGF165质粒后，对该重组质粒进行EcoRI酶切分析，电泳结果可见获得了7.9kb长度的重组质粒。受体质粒pInt.AV1.SpaT上只有一个EcoRI单酶切位点，而整合进pInt.AV1.SpaT质粒上的基因VEGF185上也只有一个EcoRI位点。从理论上分析，如果重组质粒VEGF165被位点特异性地重组到受体质粒pInt.AV1.SpaT上，用EcoRI酶切将会从重组质粒上切下来一段1kb大小的片段，剩余的片段大小约为6.9kb。重组质粒用EcoRI酶切后，切成两条片段，大小约为1kb和6.9kb，实际的酶切分析结果与理论分析相符，从而证明了转化子中的重组质粒为Cre-LoxP系统介导的含有VEGF165基因的重组质粒。 (2)倒置相差显微镜下，细胞接种的最初数日，培养物中造血细胞较多，随着培养时间延长可见细胞贴壁，其中有少量呈成纤维细胞样外形的贴壁细胞，以后这些细胞呈克隆生长。在细胞传代培养中使用条件培养基，细胞增殖速度略低于使用完全培养基组。传代后贴壁。使用条件培养基传代培养5-7d后细胞融合成单层，诱导培养2周后形成不透光的钙结节。HE染色后光镜下观察，培养的hBMSc呈梭形、多角形，有多个突起，胞浆淡蓝色，含有较大的颗粒，核可见数个深蓝色的核仁，细胞分裂相多见。扫描电镜观察开始传代培养数天的细胞多为单层细胞结构，多为梭形或多角形，有数个突起，胞体表面有颗粒状物，细胞上及细胞间可见钙盐结晶沉积。培养5-7d的细胞呈多层细胞结构，连接成片，细胞间可见丝状纤维相互连接，并有白色团块状钙盐沉积。从传代培养第2、4、6代细胞MTT法检测结果可以看出，随着传代次数的增加，细胞的增殖能力有所下降(p＜0.05)。Westernblot印迹显示：转染组在50KD处出现特征性条带，而空载体组和空白对照组未见条带。 (3)倒置相差显微镜下，三组细胞外形没有明显差异，形态基本一致。HE染色后光镜下观察，三组细胞外形没有明显差异，形态基本一致。随培养时间的延长，各组细胞数量都有所增加，各时间点经VEGF165基因转染的hBMSc吸光度值无显著性差异(P＞0.05)。经转染基因的hBMSc与转染空载体、未转染的hBMSc相比较，DNA合成前期细胞所占百分比无显著性差异，反应增殖活力的增殖指数PrI(包括DNA合成期、DNA合成后期和有丝分裂期)也无显著性差异(P＞0.05)。经转染的hBMSc碱性磷酸酶、骨钙蛋白和层粘连蛋白合成与转染空载体、未转染的hBMSc相比较有显著性差异(P＜0.05)，证实经转染的hBMSc碱性磷酸酶、骨钙蛋白和层粘连蛋白合成明显高于其它两组。 结论 (1)成功利用动态模板PCR基因合成法合成VEGF165基因，并利用含有eGFP基因中间载体pDNR质粒通过Cre-loxP系统介导与pInt.AV1.spat在细胞内实现重组，获得pInt.AV1.spat.VEGF165腺病毒表达载体，经包装后重组腺病毒滴度(T)=90×109PFU/L。 (2)在本实验条件下培养的hBMSc具有典型成骨细胞的形态学特征和较强的生物学活性，向成骨细胞方向分化效率较高，细胞数量可以满足骨组织工程研究的要求。 (3)eGFP基因转染有效示踪了VEGF165转染293细胞和hBMSc的效率。 (4)本实验证实了构建的Ad-VEGF165感染哺乳动物细胞后具有分泌VEGF165的能力，并获得了转VEGF165基因hBMSc。(5)转染VEGF165对hBMSc体外增殖和形态没有明显影响，同时可以显著提高BMSc分泌ALP，OC和LN，说明VEGF165对hBMSc体外向成骨细胞分化起到了促进作用。

目录

文摘

英文文摘

前言

第1章VEGF165和eGFP基因共表达腺病毒载体的构建与鉴定

第二章hBMSc的体外培养及VEGF165基因转染的检测

第三章VEGF165基因转染对hBMSc体外增殖分化的影响

全文总结

攻读博士学位期间成果

综述骨组织工程研究中的再血管化技术和示踪技术

缩略词表

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