我国南方口岸流行性乙型脑炎和人禽流行性感冒监测与分子流行病学研究

摘要

近二三十年，随着世界经济和环境的迅猛变化，全球传染病的发生与流行也发生了巨大的变化，一些曾被控制的传染病死灰复燃，而一些新出现的传染病又肆虐人类，生物恐怖袭击等突发公共卫生事件更威胁着国家和人民的安全。出入境检验检疫机关肩负着防止传染病在国境口岸传入传出的重任，增强传染病的快速诊断能力是当前口岸卫生检疫工作的迫切需要。尽管有些传染病目前在我国的发生率不是很高，但是在南方地区特殊的气候环境、各类人畜共患传染病的自然储存宿主和传播媒介广泛存在，成为某些传染病发生和流行的潜在因素，加之边境线长的特殊的地理位置作为有利条件，更使得我国要防止传染病经由国境口岸传入传出，不断增强传染病防控能力建设更加必要和迫切。 流行性乙型脑炎(epidemictypeBencephalitis)，又称日本脑炎(Japaneseencephalitis)，简称乙脑，是由乙脑病毒(Japaneseencephalitisvirus，JEV)引起的一种人畜共患的自然疫源性疾病。乙脑严重威胁人类(特别是儿童)健康。多数人感染后不发病，但是一旦发病后，病死率可达30％，存活者约20％～40％留有神经麻痹和心理改变等严重后遗症。 20世纪前半叶，乙脑主要在亚洲大陆的日本、朝鲜和中国等温带地区流行，日本和韩国由于采取大规模人群接种鼠脑灭活纯化疫苗，目前发病人数已下降至每年5例以下。但1969年以后泰国、缅甸、越南、老挝、柬埔寨、马来西亚、印度尼西亚、印度、尼泊尔开始有较多的病例发生或流行。20世纪90年代以后乙脑流行区域有进一步扩大的趋势。就我国而言，除西藏、新疆、青海外，全国其他省区均为乙脑流行。在1957年、1966年和1971年先后曾发生三次乙脑爆发流行，后两次发病人数分别高达15万和17万多，发病率达20/10万以上。自1976年大量使用乙脑疫苗预防接种以来，病例逐年下降，没有发生较大流行。2004年全国乙脑的报告发病例数为5422例，死亡200例；2005年在全国仍然存在不同程度的爆发流行。 人禽流行性感冒(HumanAvianInfluenza，简称人禽流感)是人接触禽流感病毒污染的排泄物或分泌物而感染并出现以呼吸道感染、黏膜充血等症状为主要表现的人禽共患病，部分感染高致病性禽流感毒株(如H5N1)的患者可出现呼吸衰竭和多器官损害，病死率较高。禽流感病毒目前可分为16个H亚型(H1～H16)和10个N亚型(N1～N10)。到目前为止，所有高致病性流感的爆发流行都是由甲型流感H5和H7亚型引起的。近来我国香港和内地发现，禽H5N1和H9N2亚型流感病毒能直接感染人。最近研究显示，禽H9N2毒株具有人流感病毒类似的受体特异性。1998年广东省首次从人咽拭子中分离到H9N2禽流感病毒，也是全世界首次从人咽拭子中分离到H9N2禽流感病毒。同时H9N2亚型毒株具有广泛的宿主范围，能感染猪，在未来有可能引起人间流感大流行。因此，H9N2流感病毒已越来越引起人们的重视。 血清流行病学是流行病学的一个重要分支，通过测定人群血清中各种成分的出现，并分析其分布规律，研究疾病在人群中存在的情况，为疾病的预防提供依据，并可为病因研究提供线索；血清学检测是疾病监测的主要手段之一。通过查明一个地区人群对某种疾病免疫水平及其动态变化，可以预测疾病发生的可能性和发生强度；而近年来发展起来的分子流行病学则是充分应用不断丰富的分子生物学理论和技术，从分子及基因水平阐明病原体的特征、进化变异规律及其群体分布等，为传染病的控制和预防提供科学依据，从而成为传染病监测新的重要手段。 本研究旨在通过对乙脑宿主动物(猪群)及其密切接触者进行乙脑血清抗体水平的调查以及对蚊媒介携带病毒的监测；通过对家禽密切接触者人禽流感病毒血清抗体水平和病毒携带的流行病学调查，探索乙脑和人禽流感的发生和传播规律，为更加有效地加强本地区人群禽流感、乙脑及其他传染病监测和防控工作提供科学依据。 方法： 1.出入境人员、猪群及其密切接触者进行血清乙脑抗体检测。密切接触者的血清样本采集自4个养猪场从业人员血清132份；本地区发热病人血清89份；猪群则选择幼猪(30天内)、中猪(3～4个月)，大猪(6个月左右，出栏前)为检测对象，共1172只； 2.对捕获的1504只蚊(养猪场：742只；各口岸：542只；其他：220只)研究媒介蚊的种群构成，尤其是三带喙库蚊分布及其蚊体内病毒的带毒情况； 3.病毒的分离、基因扩增与病毒型别鉴定和序列分析：伊蚊标本经研磨后制成悬液，直接提取病毒的RNA，或接种C6/36细胞培养后再提取RNA；进行RT-PCR；病毒的鉴定和序列分析：样本DNA，克隆到质粒，转化至大肠杆菌，进行基因序列测定； 4.检测注册禽类养殖场、屠宰场等员工、本单位有接触禽类动物的工作人员血清277份以及作为实验室对照用的非接触禽类动物的出入境人员血清270份中禽流感的抗体，以了解其抗体水平和以往的接触感染情况；研究方法包括：血凝试验和血凝抑制试验、阳性样本的反转录和聚合酶链式扩增(RT-PCR)； 5.有疑问禽流感病例时，采集其咽喉拭子或含漱液，再进行禽流感病毒核糖核酸的反转录和聚合酶链式扩增(RT-PCR)，血凝试验/血凝抑制试验阳性以及RT-PCR核酸检测阳性的样本送往国家流感中心确认。 结果： 1.在1172份猪血清样本中，乙脑IgG抗体阳性样本数为450份，阳性率为450/1172(38.4％)，而221份人群血清中，乙脑IgM抗体的实验室检测为阴性0/222(0％)，两者之间比较差异有统计学意义(x2=125.87p=0.000)。 2.在742只养猪场捕获的蚊样本中：三带喙库蚊265只占35.71％，致倦库蚊为34.50％，海滨库蚊为19.68％，中华按蚊为6.60％，数量最少的是常型曼蚊(0.14％)；各口岸捕获的542只蚊样本中：白纹伊蚊占82.47％，致倦库蚊为16.25％，海滨库蚊为0.37％，巨型阿蚊为0.37％，数量最少的是三带喙库蚊和常型曼蚊(各占0.18％)。 3.蚊液RT-PCR结果的3个阳性标本，扩增片段在600～700bp之间，不符合理论设计的835bp，经测序表明其不属于黄病毒类。细胞培养液的RT-PCR产物，克隆后测序，证实扩增出的片段是835bp。 4.蚊液RT-PCR结果的3个阳性标本都是致倦库蚊的标本，而且都来源于养猪场；细胞培养液7个阳性结果分别为：3例致倦库蚊(2例来源于养猪场，另1例来源于口岸)、3例白纹伊蚊(来源于口岸)和1例海滨库蚊(来源于养猪场)。 5.荧光定量PCR检测乙脑、登革热和西尼罗病毒，结果都为阴性。 6.养殖场和正常人群中H9、H5亚型甲型流感病毒血清学抗体调查显示：养殖场从业人员277份血清中，H5亚型抗体阳性1份，阳性率为0.36％，H9亚型抗体6份，H9抗体阳性率为2.17％；正常出入境人员血清270份，H9亚型抗体阳性8份，阳性率为2.96％，未见H5亚型抗体存在。 7.H5和H9亚型病毒血清水平：养殖场从业人员277份血清效价中，H5亚型抗体血清效价情况：1∶10有4份，占1.44％；1∶20有1份，占0.36％；H9亚型抗体血清效价情况：1∶20和1∶40各有3份；1∶20和1∶40各有3份。正常出入境人员270份H9亚型血清抗体效价情况：1∶20有2份，占0.74％，1∶40没有，1∶80有2份，占0.74％，1∶160有4份，占1.48％。禽类养殖场人群和正常出入境人群H9亚型抗体滴度(≥1∶80)阳性率比较，P＜0.05，差异有统计学意义。 8.RT-PCR扩增：H5和H9阳性血清提取RNA后，再行逆转录和RT-PCR扩增，结果没有扩增出预期的核酸带。 结论： 1.养猪场蚊虫以三带喙库蚊和致倦库蚊为主，致病媒介蚊体以致倦库蚊为主，其次为海滨库蚊；而口岸则以白纹伊蚊和致倦库蚊为主，致病媒介蚊体以白纹伊蚊为主，其次为致倦库蚊。 2.养殖场猪群存在着乙脑病毒的隐性感染或曾经感染过，猪群密切接触者和发热病人则无隐性感染。猪群可能是本地区流行性乙型脑炎传播的主要环节。 3.虫媒病毒主要是黄病毒类，也有可能存在其它的病毒，RT-PCR方法未能检出乙脑病毒、登革热和西尼罗病毒。该地是乙脑和登革热低发病率区。 4.本地区养殖场人群和出入境人群曾受到禽流感病毒H9亚型的感染，但感染率较低；养殖场人群禽流感病毒H5亚型感染只是个别现象，不能排除由本区禽类中的H5病毒感染及人的可能，也应引起注意。 5.在口岸检测传染病时，血清流行病学和分子流行病学之间方法学上存在着一定程度的差异性，也可能与病毒经常变异有关。

目录

文摘

英文文摘

前言

第一章流行性乙型脑炎分子流行病学研究

第二章注册禽类养殖场人员人禽流感血清学调查研究

小结

附录

攻读学位期间成果

致谢

个人简历

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