布鲁氏菌部分外膜蛋白基因的克隆、表达及免疫原性研究

摘要

布鲁氏菌是革兰氏阴性的兼性细胞内寄生菌，可以引发世界范围内人和牲畜及野生哺乳动物的感染，也是生物武器研究的热点。布鲁氏菌引发的传染性疾病和巨大的经济损失已经引起全世界的关注。 补体结合实验，玫瑰花环实验，血清凝集实验和酶联免疫吸附实验等经典血清学诊断均依赖布鲁氏菌脂多糖作为抗原检测相应抗体，主要存在以下的缺陷：1、布鲁氏菌脂多糖与其他的革兰氏阴性细菌的脂多糖存在交叉反应，在检测过程中可能出现假阳性的结果；2.不能根据血清学检验鉴别天然感染和接种过疫苗。因此寻找蛋白抗原成为解决布鲁氏菌的诊断中存在的这些缺陷的主要方向。 目前减毒活菌疫苗是预防布鲁氏菌的主要手段，但是由于减毒活疫苗可能存在毒力回复以及隐性感染等危险，一直未能应用于人类的布鲁氏菌预防。而且和其他细胞内寄生细菌一样，布鲁氏菌的LPS具有较低的免疫原性，不能引发足够清除病原的免疫反应，是布鲁氏菌能够在宿主细胞内存活并繁殖的一个重要原因，因此寻找蛋白性质的抗原具有重要的意义。 国外的研究工作已经对一些布鲁氏菌的外膜蛋白进行了免疫原性和保护性的研究，期待能够应用于布鲁氏菌诊断和亚单位疫苗的制备。其中OMOP31、OMP10和bp26均为强免疫原性蛋白并具有保守的DNA序列。尤其是bp26在一些疫苗株中的弱化和缺失对于鉴别天然感染和疫苗接种具有现实意义。 在此次研究中我们自布鲁氏菌基因组中扩增获得OMP31、OMP10和bp26的基因片断并克隆至原核表达载体PGEX-4T-1，经IPTG诱导之后成功表达了上述三种蛋白，分别命名为GST-OMP31,GST-OMP10和GST-bp26。并通过western-blotting实验检测其免疫特性，结果显示三种蛋白均能够被布鲁氏菌感染兔血清特异性识别，而载体蛋白与阳性血清并不能产生反应，证明这三种蛋白具有良好的抗原特异性，可期待应用于布鲁氏菌的诊断。 根据这三种蛋白不同的理化特性，我们采用了不同的纯化方式进行了蛋白的纯化，其中GST-OMP31和GST-bp26获得了良好的纯化效果，而OMP10在纯化的过程中未能够保持稳定，发生了降解。 纯化后的GST-OMP31和GST-bp26蛋白分三次，第一次使用完全弗氏佐剂，后两次采取不完全弗氏佐剂作为佐剂免疫小鼠。两种蛋白均能诱导高滴度的体液免疫。通过淋巴细胞增殖实验、细胞因子分析和CD4+、CD8+和CD86+淋巴细胞亚群分析，结果显示GST-OMP31免疫小鼠脾细胞经GST-OMP31刺激之后可以产生IFN-γ而不是IL-4，提示GST-OMP31诱导的是Th1型免疫反应。并且能够诱导特异性细胞毒反应，导致提呈抗原的巨噬细胞的溶解凋亡。此外，小鼠体内CD4+和CD8+淋巴细胞记数的减少提示，GST-OMP31免疫诱导小鼠CD4+淋巴细胞产生IFN-γ从而诱导产生CD8+T细胞的特异性细胞毒作用。结果显示，OMP31诱导的免疫主要由CD4+淋巴细胞产生，而CD8+淋巴细胞的作用因此而收到了限制。 GST-bp26相对于GST-OMP31来说不仅能够诱导Th1型免疫反应，产生干扰素和特异性细胞毒细胞，也能够诱导Th2型免疫反应，产生IL-4和TNF-α。淋巴细胞增殖实验和CD4+、CD8+和CD86+淋巴细胞亚群分析结果显示，Th1型和Th2型免疫反应的相互拮抗作用使GST-bp26相对于GST-OMP31来说能够维持更长时期的免疫保护作用。 和其他细胞内寄生菌一样，激活的巨噬细胞对于宿主清除感染病原来说是非常重要的。TNF-α能够激活巨噬细胞和促进炎症反应，酶联免疫吸附测定细胞因子结果显示，GST-OMP31诱导TNF-α产生的能力有限，而GST-bp26在免疫的全过程中维持一个较高的TNF-α水平。 结果显示虽然GST-bp26不能产生和GST-OMP31一样强烈的细胞免疫反应和细胞毒作用，但是它能够同时激活Th1型和Th2型免疫反应从而提供更长效的保护性作用。因此，外膜蛋白OMP31和bp26都是制备布鲁氏菌疫苗的候选成分。

目录

文摘

英文文摘

前言

第一部分 布鲁氏菌外膜蛋白OMP31、bp26和OMP10重组表达质粒的构建及表达

第二部分 重组布鲁氏菌OMP31、bp26和OMP10蛋白的纯化和鉴定

第三部分 布鲁氏菌外膜蛋白OMP31和bp26在小鼠体内免疫应答的研究

参考文献

附录

硕士期间论文发表情况

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