促进游离移植组织再血管化之细胞疗法的种子细胞来源探讨

摘要

研究背景：游离组织移植是整形与修复重建外科的基本技术，游离的组织移植到受区以后，其血液供应是成活的基础。早期的营养供应主要依赖供体周围组织液的血浆营养，但这种营养供应是有限的，不能保证供体的长期存活，仅能帮助其渡过早期的缺血缺氧状态；移植48小时后，供体组织开始与受区血管床建立新的血液循环，此再血管化过程是游离移植能否成功的决定因素，再血管化不及时或不充分都会导致供体组织发生坏死。因此探索促进游离移植组织再血管化的手段，是整形外科技术发展的迫切需要，特别是在游离脂肪移植领域，如能解决移植后的血供问题，就能突破游离脂肪移植在临床应用中的瓶颈问题——中心性坏死、吸收和纤维化。 细胞疗法是指应用自体、异体或同种异体的细胞，经体外操作后回输(或植入)人体，以达到治疗、诊断或预防作用的目的。细胞疗法最初和最成功的范例是输血和骨髓、造血干细胞移植。近年来，随着人们对干细胞研究的不断深入，细胞疗法的治疗领域不断拓宽，延伸到了肿瘤的生物治疗、免疫治疗，糖尿病、冠心病的治疗等领域。细胞疗法也能有效地促进血管生成和创面愈合，保护缺血缺氧组织。到目前为止，骨髓基质干细胞、脂肪干细胞和内皮祖细胞都有确实的促进组织再血管化作用的证据。 然而，要满足实际应用的需要，细胞疗法的种子细胞除了需有明确的治疗作用外，还要满足来源充足、易于采集、体外扩增能力强等条件。综合这些考虑，内皮祖细胞(Endothelial Progenitor Cells，EPCs)和脂肪干细胞(Adipose—Derived Stem Cells，ASCs)是比较好的两个选择。EPCs被认为是血管内皮细胞的前体，它来源于骨髓，能从外周血中分离获得，病理应激状态下能富集到缺血损伤部位，参与新血管的生成。所以从理论上说，它是促进移植物再血管化的理想种子细胞。但EPCs的体外增殖能力不强且外周血中含量很少，是它作为种子细胞来源的缺点，使用培养晚期出现的晚期EPC有望弥补这个缺陷。ASCs能从脂肪组织中大量获得，是一具有多向分化潜能的间充质干细胞，具有来源充足、易于采集、体外扩增能力强的优点。ASCs也具有促血管化作用，能在缺血部位分化为血管内皮细胞参与血管新生，还能分泌促进血管新生的多种细胞因子。鉴于细胞间相互作用的重要性，我们设想将EPCs与ASCs混合，可能利用ASCs促进EPCs的增殖，并利用EPCs诱导ASCs向内皮方向分化，使二者的组合成为促血管化种子细胞的“黄金搭档”。目的：探索如何获取采集方便、来源充足、易于扩增的促血管化种子细胞，以应用于细胞疗法，促进游离移植组织的再血管化。 方法：1、分离培养成人外周血来源EPCs采集健康成人肘静脉血，PBS等倍稀释后，叠加到Ficoll淋巴细胞分离液上，离心后小心吸取中间单个核细胞层，M199培养基洗涤两次，重悬于含有20％胎牛血清、10ng/ml VEGF的M199培养基中，接种于人纤维连接蛋白(humanfibronectin，hFN)包被过的6孔板中，置饱和湿度、5％CO<,2>、37℃孵育箱中进行培养，第4天首次换液，此后每2至3天酌情换液。 2、观察成人外周血来源：EPCs在体外培养过程当中的细胞生物学特性演变每日对EPCs进行大体形态观察并摄像，分别于第7日及第21日，将EPCs用0.25％胰蛋白酶消化下来，行CDllc、CD14、CD31、CD34、CD44、CD45、CD133、vwF、flk-1的流式细胞学分析。 将EPCs接种在hFN包被过的盖玻片上，于第7天时取出，固定后行vWF，CD31，CD34的免疫组化染色检查。将培养至第21天的EPCs消化下来，制作细胞爬片，行vWF免疫组化染色检查。 3、分离培养人ASCs人ASCs由南方医科大学南方医院整形外科朱茗硕士惠赠，以普通高糖DMEM培养基+10％胎牛血清进行培养，每3至5天传一代。 4、成人外周血来源EPCs与人ASCs的混合培养将第5代的ASCs消化下来，重悬于M199完全培养基中，在EPCs首次换液时(第4天)接种于长有EPCs的培养板中，同一板上不加的孔为对照，24小时后首次换液，之后换液方法同EPCs，的方法。 5、ASCs向内皮细胞方向的诱导培养从脂肪抽吸物中分离出ASCs，分离出来后分为两部分，一部分使用EPC的完全培养基(M199+VEGF lOng/ml+20％FCS)进行诱导培养，一部分用普通DMEM高糖培养液进行正常传代培养，作为阴性对照。1月后分别对诱导和未诱导的ASCs行CD29、CD31和CD45的流式细胞学分析。 结果与讨论：1、外周血来源单个核细胞接种后约有1/20贴壁。第4天左右可形成从中心向外放射的典型EPC集落，第7天有大量长梭形、双极针样细胞生长，流式细胞学分析显示它表达CD11c、CD14、CD44，弱表达CD31、flk-1、vWF，不表达CD34、CD133。免疫组化染色结果显示：CD31表达阳性，vWF表达弱阳性，CD34表达阴性。说明培养第7天的外周血来源单个核细胞表达单核巨噬细胞系相关抗原阳性，表达内皮细胞系相关抗原弱阳性，表达造血细胞系相关抗原阴性，符合内皮祖细胞的表型特征，且本实验结果支持EPCs与单核细胞同源的学说。 2、将上述细胞继续培养，第7-10天左右长梭形细胞开始减少，同时出现大量椭圆形细胞，呈内皮细胞典型的鹅卵石样，符合晚期内皮祖细胞的形态。第3 周时长梭形细胞已基本消失，而椭圆形细胞增殖旺盛。流式细胞分析显示培养第2l天的细胞表达CD31、vWF明显增加，而CD44的表达明显下降，CD34的表达仍为阴性。培养至第21天的细胞爬片行vWF因子免疫组化染色显示为阳性。说明原代培养晚期(第2周以后)能出现更符合内皮细胞特征的晚期内皮祖细胞(1ate EPC)，与培养早期(第4～7天)出现的早期EPC(early EPC)相比，其内皮细胞系相关抗原的表达增强，而单核巨噬细胞系相关抗原的表达减弱。3、ASCs与原代EPCs共同培养第2天，可见共同培养组的EPCs较对照组的更为伸展，细胞数目也更多；第3天仍可见相同现象。说明ASCs与EPCs共同培养时，能促进EPCs的增殖分化。 4、ASCs在EPCs的完全培养基中培养1月后，流式细胞学分析显示其CD31表达明显上调，CD29的波形变为双峰状。说明此时细胞成分已发生了改变，出现了高表达内皮细胞相关抗原CD31的细胞群。 小结：1、本实验从成人外周血中成功分离培养出了EPCs，并证实其表达单核巨噬细胞系相关抗原，但不表达造血细胞相关抗原，为EPCs表面标志的鉴定提供了新的证据。 2、在国内首先对EPCs在体外培养过程中的变化作了观察，并从成人外周血中分离培养出了增殖能力较强，在细胞疗法领域具有更大实用价值的晚期EPC。 3、在国内外首次提出了联合使用EPCs与ASCs促进组织再血管化的设想，并对EPCs与ASCs的相互作用作了初步的探索，观察到了ASCs促进EPCs增殖分化的现象。 4、对ASCs向内皮细胞方向分化做了初步的尝试，观察到了ASCs在EPCs的培养条件下能向内皮细胞方向分化。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：中英文缩略词对照表

声明

前言

第一章成人外周血来源内皮祖细胞的分离培养和鉴定

材料和方法

实验结果

讨论

结论

第二章晚期内皮祖细胞的分离培养

材料与方法

实验结果

讨论

结论

第三章脂肪干细胞与内皮祖细胞的混合培养

材料与方法

实验结果

讨论

结论

参考文献

文献综述：血管内皮细胞的不同来源、体外培养方法及其在细胞组织工程中的应前景

攻读学位期间的成果

致谢