葡聚糖-寡胺阳离子化合物的制备及其基因转染效率的研究

摘要

本研究的目的是制备具有转基因功能的葡聚糖-寡胺阳离子化合物基因载体，其意义在于探索非病毒基因载体，解决基因治疗的载体问题。目前用于基因治疗的病毒性载体虽然具有较高的转染效率，但其体内毒性、免疫原性等诸多缺陷限制了其应用，而安全无毒、生物相容性好的非病毒基因载体则有望弥补病毒性载体的不足并成为基因治疗的新一代载体。 以目前非病毒基因载体中前景较好的葡聚糖-寡胺阳离子化合物为研究对象，从多种葡聚糖-寡胺阳离子化合物中优选出转染能力最强的载体，并对其进行进一步的研究，力图找出影响该化合物基因转染能力的因素和内在规律。本研究的主要研究方法、内容、结论包括以下几个方面。 首先，将分子量不同的葡聚糖10(Dextran10)、葡聚糖40(Dextran40)、葡聚糖70(Dextran70)分别氧化成三种氧化度不同的氧化葡聚糖，共制备9个品种的氧化葡聚糖，并以盐酸羟胺法测定了各种氧化葡聚糖分子上的醛基含量。在预试验的基础上以载体的基因转染效率为考察指标，通过正交试验考察影响载体转染效率的因素并优选载体的制备条件，结果氧化葡聚糖的种类、氧化葡聚糖的氧化度(醛基含量)、反应物寡胺与醛基的配比、寡胺的种类四种因素对转染效率均有显著的影响(p值均小于0.05)，载体的最佳制备条件为：高氧化度的氧化葡聚糖40与精胺以1：1.2的摩尔比反应生成的载体的转染率最高，在该条件下制备5批样品，结果5批样品均具有较高的转染效率，说明正交试验结果的可重复性。正交试验结果尚表明，在所考察的因素水平内，反应物精胺与氧化葡聚糖的醛基摩尔比越大生成的载体转染率越高；葡聚糖的氧化度越高生成的载体的转染率越高；寡胺种类对载体转染率影响的优劣次序为精胺＞聚乙烯基亚胺(PEI)＞精脒；氧化葡聚糖种类对载体转染率影响的优劣次序为氧化葡聚糖40＞氧化葡聚糖10＞氧化葡聚糖70。 其次，对合成的基因转染效率最高的葡聚糖-精胺阳离子化合物非病毒基因载体进行理化表征。 以红外光谱、核磁共振波谱、紫外光谱对载体进行化学表征；以透射电子显微镜、激光纳米粒度测定仪考察载体的形态大小和表面电性；以三硝基苯磺酸法和元素测定仪对葡聚糖-精胺阳离子化合物上的精胺进行定量测定。 红外测试、核磁共振测试及紫外测定结果均表明，经过多步反应精胺以碳氮单键连接到氧化葡聚糖分子上，生成了目标物葡聚糖-精胺阳离子化合物非病毒基因载体。 透射电子显微镜和激光纳米粒度测定仪检测结果进一步表明，所制备的葡聚糖-精胺阳离子化合物为纳米尺寸的粒子，大小130nm；形状类圆形。激光纳米粒度测定仪检测结果尚表明载体表面带有较多的正电荷，表面Zeta电位+31.1。 定量测定结果表明，载体的精胺总含量为1.82mmol/g，载体上含伯胺基的精胺含量为1.18mmol/g，连接到氧化葡聚糖分子上的精胺存在两种形式，一种形式是一端伯胺基与氧化葡聚糖相连，另一端的伯胺基处于游离状态；另一种形式是两端的伯胺基均与氧化葡聚糖分子相连。后一种存在形式可形成反应物分子之间的交联，这种交联是形成葡聚糖-精胺阳离子化合物纳米粒的原因。 第三，含绿色荧光蛋白基因的质粒DAN(pEGFP-C1)的制备。 将含绿色荧光蛋白基因的质粒DAN转入大肠杆菌；增殖大肠杆菌，使质粒扩增；以碱裂解法从大肠杆菌中提取质粒DAN；以聚乙二醇分级沉淀法进一步纯化提取的质粒DNA，去除碱裂解法得到的质粒DNA中的少量染色体DNA、大量RNA、构型为线状及缺口环状的pEGFP-C1，以便使pEGFP-C1适用于哺乳动物细胞的基因转染。 经检测所制备的产物为所需要的pEGFP-C1：共价闭合环状的pEGFP-C1，分子量4.7Kb。 第四，基因转染试验。 本试验以葡聚糖-精胺阳离子化合物基因载体为试验载体、以pEGFP-C1为报告基因、以SMMC-7721人肝癌细胞为转染细胞，考察载体对DNA的结合和压缩能力，研究载体与DNA电荷比等不同因素对载体转基因效率的影响。 结果表明，载体对DNA具有压缩能力，并且随着载体的用量增加形成的载体-DNA复合物的粒径减小；载体与DNA电荷比对转染效率有影响，二者电荷比在15以下时转染率较低，电荷比增加至15时突然升高，再继续增加载体的用量则出现细胞中毒现象；合成载体时精胺与醛基摩尔比对转染效率有影响，二者摩尔比增加，生成载体的转染效率增加，但二者摩尔比增加至1.2时，再继续增加摩尔比生成的载体的转染率增加不明显；氧化葡聚糖的氧化度对转染效率有影响，在精胺足量的情况下(精胺/醛基摩尔比1.2)，氧化葡聚糖的氧化度越高生成的载体的转染率越高。载体最佳条件下的基因转染效率达到31.1％。

目录

文摘

英文文摘

前言

第一章葡聚糖-寡胺阳离子化合物纳米粒非病毒基因载体的合成

第二章基因载体的表征

第三章pEGFP-C1报告基因的制备及鉴定

第四章基因转染

全文小结

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参考文献

致谢