免疫缺陷鼠-人RA移植物嵌合体模型的研制及应用

摘要

一．背景和目的 类风湿关节炎(RA)是一种以关节滑膜炎症为病理中心的自身免疫性疾病。滑膜增生并形成血管翳是软骨和骨质破坏的关键因素。既往对RA的病理机制研究多强调RA的T细胞介导自身免疫炎症反应这一环节，滑膜成纤维样细胞(SFs)只是当作“被动参与者”，受T细胞和炎症因子刺激而出现增生和软骨侵蚀。但近年来逐渐关注到RA滑膜成纤维样细胞(RASFs)本身在RA病理进程中的作用。由于RASFs具有转化细胞特征，即使在无T细胞和炎症因子的环境中，单纯的RASFs同样能增生并侵袭软骨。因此提出，RASFs是一个“主动入侵者”，在RA的病理机制是扮演关键角色。这也是临床上应用免疫抑制剂或抗炎镇痛药虽然能缓解症状，但最终并不能阻断病情进展和关节骨质破坏的原因。基于此，寻找能真正抑制RA滑膜增生并阻断软骨和骨质侵蚀进程的药物已成为RA研究的焦点。 要达到上述目标，良好的动物模型是不可缺少的技术平台。既往各种诱导型关节炎动物模型如胶原诱导性关节炎，佐剂诱导性关节炎等，它们的滑膜增生都是受免疫炎症反应驱动，并不能体现RA滑膜自身增生和侵蚀。因此，上世纪90年代中期开始，将RA滑膜移植到免疫缺陷动物身上构建免疫缺陷动物-人RA移植物嵌合体模型的研究工作迅速得到重视。该模型在RA滑膜增生的病理机制，特别是筛选以抑制滑膜增生和软骨侵蚀为目标的药物或治疗方法中得到广泛应用。而国内对该模型的研制工作才刚起步。免疫缺陷动物主要有裸鼠，SCID(T、B细胞功能缺陷的联合重度免疫缺陷)小鼠和NOD/SCID、：BNx(T、B、NK细胞三缺陷)小鼠。目前广泛应用的是SCID小鼠，BNX鼠能否作为RA滑膜移植载体尚未见报道。既往我们实验显示南蛇藤醇提物具有良好的抗炎镇痛和免疫抑制作用，但作为RA治疗价值还有待观察它是否能真正抑制RA滑膜增生和软骨侵蚀。Etanercept是目前应用最多的一种TNF-a拮抗剂，在RA的临床治疗中有显著作用，但作为一种TNF-a受体融合蛋白能否真正抑制滑膜增生和软骨侵蚀尚未见在体实验的直接依据。 为了进一步了解RA滑膜增生和软骨侵蚀的机制，探讨BNX鼠构建免疫缺陷鼠/人RA移植物模型的可行性，观察南蛇藤是否能真正抑制RA滑膜增生和软骨侵蚀并探讨其机制，深化Etanercept治疗RA的药理作用途径，我们开展了本项目的研究。 二．研究内容和方法 本研究主要有3个方面内容： 一是构建NOD/SCID鼠-人类风湿关节炎移植物嵌合体模型(NOD/SCID-HuRAg)，并与NOD/SCID鼠-人骨关节炎(OA)滑膜移植物模型进行比较； 二是以NOD/SCID-HuRAg模型评价南蛇藤醇提物治疗RA的作用机制并与来氟米特对照： 三是以BNX-HuRAg模型评价Etanercept治疗RA的作用及机制。 1．造模方法：将RA(或OA)患者关节镜下钳取的滑膜组织修剪成0.3×0.5cm大小，将截肢患者的正常关节软骨修剪成0.5×0.8cm大小。戊巴比妥麻醉状态下在NOD/SCID鼠或BNX鼠背部作纵行切口，将一块软骨植入皮下，再将两块滑膜组织置入软骨上，缝合切口。以上操作均在无菌环境中进行，动物在SPF级屏蔽环境饲养管理。 2．给药方法：NOD/SCID-HuRAg随机分为3组，每组8只，术后第29d开始分别给予蒸馏水，南蛇藤醇提物(30mg/d)及来氟米特(500ug/只)灌胃，每同1次，持续4周。BNX-HuRAg模型随机分为2组，每组10只，术后第29d开始分别给予Etanercept(100ug/只)和注射用水(对照)在移植物附近皮下注射，一周2次，连续4周。 3.指标检测：术后第61d眼球取血，整体剥离滑膜软骨移植物。血清标本作TNF-a定量检测(放免法)和细胞调亡程度(TUNEL法)。组织学评价主要包括滑膜增生，软骨侵蚀和软骨细胞周围的软骨降解三个内容，分别采用积分表示病变程度。原位杂交片和细胞凋亡片经自动图象分析，提取反映阳性信号强弱的平均光密度值(MIOD)和阳性信号多少的平均着色面积(MSA)作半定量分析。 4.统计处理：实验结果以均数加减标准差( +j)表示，用SPSSl0.0软件进行分析。首批NOD/SCID-HuRAg模型与NOD/SCID-HuOAg模型组之间，以及Etanercept给药的2组BNX-HuRAg模型之间的数据采用Independent-SamplesTTest检验。南蛇藤给药3组NOD/SCID-HuRAg模型之间的数据采用One WayANOVA方差分析，两两多重比较采用LSD法或SNK检验，方差不齐性时采用Games--Howe Ⅱ检验。检验水准a=0.05。 三.结果 实验期间移植物均在小鼠体内存活，小鼠未出现移植物抗宿主反应。 1.NOD/SCID-HuRAg与NOD/SCID-HuOAg比较，前者滑膜增生(3.111±0.054 vs 2.000±1.000，p<0.05)，软骨侵蚀(3.556±0.527vs 1.278±0.051，p<0.01)和软骨降解的程度(3.111±0.782 vs 1.778±0.833，p<0.01)均较后者高，增多有显著性意义。前者的滑膜细胞中VEGFmRNA阳性表达常见，而后者少见。前者的细胞凋亡程度却显著减少(MIOD：168.371±12.866 vs 959.226±80.886.p<0.01：MSA：180.210±8.206 vs 1890.510±159.139，p<0.01)。 2.南蛇藤与来氟米特均能显著降低NOD/SCID-HuRAg模型中的滑膜增生。(分别为2.000±0.756，2.250±0.886 vs3.625±0.517，p<0.01)、软骨侵蚀(1.687±0.799，2.000±1.362 vs 3.750±0.535，p<0.01)和软骨降解(1.875 ±0.835，2.125±0.835 vs 3.635±0.744，p<0.01)的积分，并显著降低血清TNF-a含量(0.840±0.088，0.803±0.068 vs 0.993±0.114，p<0.01，ng/ml)。无论MIOD(350.595±253.354， 354.002±265.903 vs 75.138±44.793，p<0.05)还是MSA(932.324±715.187，892.480±563.899 vs 191.331±115.550，p<0.05)，均显示二种药物均显著促进了滑膜细胞凋亡。而南蛇藤醇提物还能显著下调滑膜TNF-a mRNA的表达，来氟米特组的差异无统计学意义。 3.滑膜和软骨在BNX鼠体内生长良好。 Etanercept组中滑膜增生(2.100±0.994 vs 3.700±0.483，p<0.01)、软骨侵蚀(1.550±0.726 vs 3.750±0.535，p<0.05)、软骨降解(1.300±0.823 vs 3.635±0.744，p<0.01)积分以及血清TNF-a含量(0.596±0.095 vs 0.694±0.112，p<0.05，ng/m1)均显著降低；同时，Etanercept还能显著下调滑膜细胞的TNF-a mRNA的表达(MIOD：35.336±32.277 vs162.664±142.269，P<0.05；MSA：127.185±117.824 vs 582.376±530.321，P<0.05)和VEGF mRNA(MIOD：75.580±34.115 vs 211.944±114.096，P<0.01：MSA：201.530±82.974 vsS 552.965±413.223，P<0.05)。但对滑膜细胞凋亡的影响则无显著差异。 四.结论 人RA滑膜和正常关节软骨在NOD/SCID鼠和BNX鼠体内均能良好生长。移植后RA滑膜细胞继续保持增生和侵蚀能力，且继续高表达TNF-a和VEGF，而细胞凋亡则明显受抑。南蛇藤醇提物能显著抑制RA的滑膜增生，减轻滑膜对软骨侵蚀和软骨细胞介导的软骨降解，其作用机制包括抑制RA滑膜组织的TNF-a的产生和促进滑膜细胞凋亡。其作用效果与来氟米特相似，但在抑制滑膜TNF-a表达方面南蛇藤强于来氟米特。Etanercept也具有抑制RA滑膜增生和软骨侵蚀及降解作用，其作用机制除了中和滑膜组织和血液中的TNF-a外，还可能与下调滑膜细胞的VEGF表达有关。NOD/SCID-HuRAg和BNX-HuRAg模型是RA病理机制研究和相关药理药效学研究的重要工具。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：中英文缩略词对照表

声明

第1章前言：研究目的和意义

1.1滑膜细胞在类风湿关节炎发病机制中的中心地位

1.2免疫缺陷鼠-人类风湿关节炎异种移植模型的发展和应用

1.2.1免疫缺陷鼠的背景资料

1.2.2SCID鼠-人RA异种移植模型的发展

1.2.3 SCID鼠-人RA异种移植模型的应用

1.3南蛇藤及Etanercept治疗类风湿关节炎的药理作用

参考文献

第2章NOD/SCID鼠-人类风湿关节炎移植模型的建立及比较

2.1材料和方法

2.1.1主要实验材料及仪器、设备

2.1.2实验方法

2.2结果与分析

2.2.1模型鼠生存情况

2.2.2血清TNF-α含量

2.2.3组织学观察

2.2.4 VEGF mRNA的表达

2.2.5滑膜细胞的细胞凋亡

2.3讨论

参考文献

第3章NOD/SCID-HuRAg模型评价南蛇藤醇提物治疗RA的作用及机制

3.1材料与方法

3.1.1材料

3.1.2实验方法

3.2结果与分析

3.2.1移植物的组织学评价

3.2.2血清TNF-α含量

3.2.3滑膜TNF-α mRNA的表达

3.2.4移植物细胞凋亡情况

3.3讨论

参考文献

第4章BNX-HuRAg模型评价Etanercept治疗RA的作用及机制

4.1材料与方法

4.1.1动物

4.1.2人RA滑膜及正常关节软骨

4.1.3主要试剂及药物

4.1.4 BNX-HuRAg嵌合体模型的建立

4.1.5分组及给药

4.1.6血清TNF-α放射含量测定

4.1.7病理制片及组织学观察

4.1.8 TNF-α及VEGF mRNA原位杂交检测

4.1.9细胞凋亡TUNEL法检测

4.1.10统计学处理

4.2结果与分析

4.2.1组织学评价

4.2.2血清TNF-α含量

4.2.3滑膜TNF-α mRNA的表达

4.2.4滑膜细胞凋亡情况

4.2.5滑膜VEGF mRNA的表达情况

4.3讨论

参考文献

全文小结

攻读学位期间成果

致谢