人肾癌相关抗原G250的克隆、表达、单抗制备和放射免疫显像的初步研究

摘要

研究背景 肾癌又称肾细胞癌(renal cell carcinoma，RCC)，是最常见的成人肾脏实质恶性肿瘤，其发病率居泌尿系统肿瘤的第二位，而且呈逐年上升的趋势。其起病隐袭，死亡率高。 肾癌早期症状不典型，目前的诊断主要依靠B超、CT、MRI等影像学方法并结合临床医生的经验。这些方法对于肿瘤良、恶性的区分，判断淋巴结转移和反应性增大，对肾癌远处转移、手术后局部复发的早期诊断都有一定的困难。细胞学诊断上，由于穿刺活检有引起针道转移的可能，其应用一直存在争论，目前国内外绝大多数医疗单位都不采用。术中活检、冰冻病理切片检查也存在种植转移的可能，而且受到取材部位和病理医师经验等方面的影响比较大。肾脏良、恶性肿瘤的明确诊断对于治疗方法的选择和判断预后具有决定性的作用。因此国内外许多学者正致力于寻找具有良好的敏感性和特异性的诊断方法。 由于肾癌对传统的放、化疗均存在抵抗，目前手术仍是主要的治疗手段。对于局限性肾癌应选择肾癌根治术，而对于伴有转移的肾癌，只要条件允许，应该先行减瘤性手术(辅助性手术)，以达到最小残余病灶的目的，然后进行综合治疗。在各类恶性肿瘤中，肾癌的外科治疗效果是比较好的。有报道早期肾癌手术治疗后，5年生存率可以达到60～65％。对于有转移的进展期肾癌，免疫治疗是手术外的首选方法，目前主要应用的是白介素2(IL-2)和干扰素α(INF-α)，但是其疗效十分有限，总缓解率仅为10％～20％。不良反应大以及缺乏靶向性是其缺点。为了提高肾癌治疗的效果，寻找特异性的肿瘤相关抗原并以此为靶点进行诊断、治疗是肾癌研究的一大课题。近年来研究发现，G250/MN/CAⅨ(以下简称G250)显示了良好的肿瘤特异性，被认为是较为理想的肿瘤相关抗原(tumor associated antigen，TAA)，在肾癌的诊断、预后判断和生物治疗等方面有较好的应用前景。 人G250是分布于细胞膜和细胞核膜表面的跨膜糖蛋白，是碳酸酐酶的异构酶，命名为碳酸酐酶Ⅸ。研究表明98％的肾癌原发灶有G250抗原表达，尤其是透明细胞癌全部有表达，88％的转移灶有该抗原表达，而在正常组织中仅限于胃黏膜和大胆管上皮细胞有少量表达。因此G250具有良好的肿瘤特异性，是较理想的肿瘤标记物和肾癌治疗靶点。 随着对G250研究不断深入，利用G250在肾癌细胞膜上的特异性表达，直接或间接地产生了许多肾癌诊断、治疗的新思路和方法。比如G250单克隆抗体(G250 McAb)可以直接攻击表达G250的肾癌细胞，肾癌细胞表面的G250抗原可以增强抗体依赖的细胞介导的细胞毒反应(ADCC)，利用核素标记的G250McAb进行肿瘤放射免疫显像、放射免疫治疗以及利用G250在肾癌细胞上表达的特异性和免疫原性进行肿瘤疫苗的研究等。目前国内这方面的研究较少，尚未成功进行该抗原的表达、纯化。国外的G250单克隆抗体尚未商品化，制约了相关研究的开展。 本研究的目的是：利用基因工程技术表达、纯化G250抗原，以其为免疫原，采用杂交瘤技术，制备鼠源性抗G250的单克隆抗体，以放射性核素标记制备的单抗，在荷瘤裸鼠体内进行放射免疫显像的初步研究。期望为探索肾癌的早期诊断方法提供实验依据。研究内容共分为三部分： 第一部分人肾癌相关抗原G250蛋白的克隆、表达和纯化； 第二部分G250单克隆抗体的制备与初步鉴定； 第三部分放射免疫显像的初步研究。 第一部分：人肾癌相关抗原G250蛋白的克隆、表达和纯化获得具有免疫活性的G250蛋白是制备单克隆抗体和进行蛋白功能研究的基础。在此部分，研究目的是进行G250的克隆，构建稳定、高效的原核表达载体，表达并纯化具有免疫活性的G250蛋白。 以构建于pET-22b(+)/G250载体上的人G250全长质粒为模板，设计带有相应酶切位点的引物，采用PCR法进行G250的序列扩增，扩增产物插入pET-32a(+)构建表达载体pET-32a(+)/G250。经酶切鉴定和测序正确后，转化E.coli.Rosseta。经优化表达条件后，在37℃，IPTG的浓度0.8mmol/L，诱导5小时，细菌裂解液进行SDS-PA(讵电泳，在约58 kD处出现特异蛋白带。细菌裂解后SDs-PAGE发现融合蛋白表达以可溶性为主。His亲和层析后也在分子量约58 kD处有一条高纯度的蛋白带。Bradford法定量结果为0.7mg/ml。Western-blot结果表明，G250融合蛋白具有良好的免疫原性。 第二部分：G250单克隆抗体的制备与初步鉴定以G250单克隆抗体为基础的放射免疫显像和放射免疫治疗研究取得了一定的进展，但是因为国内无法得到足够的抗体，制约了相关研究的开展。在此部分的研究目的是以G250蛋白为免疫原，采用杂交瘤技术制备单克隆抗体，为下一步的研究提供基础。 对多次纯化的G250进行浓缩至约2 mg/ml。以其作为免疫原常规免疫BALB/c小鼠。小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合。筛选阳性克隆并采用有限稀释法进行亚克隆化筛选、鉴定。分别以G250融合蛋白进行正筛选，pET-32a载体蛋白进行负筛选。得到7株仅与G250融合蛋白反应而与载体pET 32a蛋白不发生反应的杂交瘤细胞株，命名为GM001、GM002、GM003、GM004、GM005、GM006、GM007。 经测定，7株杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体中，GM003重链为IgM，GM004．重链为IgG2a，其余5株重链均为IgGl；GM007轻链为λ链，其余6株均为1(链。用间接ELISA方法测定7株：McAbs效价在1:8000～1:64000，其中(3M002，GM005，GM006腹水的抗体效价是1:32000～1:64000。非竞争ELISA法测定单抗的反应曲线，计算亲和常数介于l×10<'-8> L/M～1×10<'-10>L/M之间。 挑选3株效价较高的McAbs进行Western-blot实验，结果显示3株单抗均能特异性识别G250蛋白，而与载体蛋白pErr-32a无反应。 挑选单克隆抗体GM005进行免疫组化实验，结果显示GM005与肾透明细胞癌有阳性反应，而且着色部位主要在细胞膜；与集合管癌、肾母细胞瘤反应阴性；与子宫内膜癌、乳腺浸润性导管癌、甲状腺髓样癌、直肠腺癌、肝细胞癌均呈阴性反应。 第三部分：放射免疫显像的初步研究单抗GM005和对照抗体鼠IgG以2-巯基乙醇(2-ME)还原，采用直接标记法进行抗体GM005和鼠IgG的放射性核素<'99m>Tc标记。纸层析法测定<'99m>TC-GM005标记率90％以上，放射化学纯为96％。间接ELISA法和免疫组化结果显示<'99m>TC-GM005仍具有免疫活性。 以人肾癌细胞株786-0颈部皮下注射制备荷人肾癌裸鼠模型。待瘤体生长至约1cm时进行显像实验。 <'99m>Tc-GM005静脉注入荷瘤鼠后于2，8，24小时采像，肿瘤部位有放射性浓聚，并且随着时间的推移显像愈明显，<'99m>Tc-鼠IgG给药后，瘤体一直未见显影。给药后24小时，肿瘤组织对<'99m>Tc-GM005的摄取(％ID/g)比肿瘤组织对<'99m>Tc-鼠IgG的摄取(％ID/g)高，两者之间有统计学意义(P<0.001)。<'99m>Tc-GM005组各组织器官的T/NT值比<'99m>Tc-鼠IgG组高，两者之间有统计学意义(P<0.002)。表明<'99m>Tc-GM005有良好的靶向性，而<'99m>Tc-鼠IgG无靶向性，这与显像实验的结果相吻合。 结论 成功完成人G250的克隆并构建表达载体pET32a(+)/G250。在大肠杆菌EcoliRosseta中稳定、高效地表达人G250融合蛋白。 以G250融合蛋白为免疫原，在国内首次成功地制备、筛选G250单克隆抗体。免疫组化结果显示，制备的单抗与肾癌组织有特异性反应。 利用制备的单抗标记放射性核素，放射免疫显像结果显示放射性核素在肿瘤部位有浓聚，而且随着时间的延长显像愈加清晰，实验组T/NT比值较高，说明单抗能与肾癌组织特异性地结合，在肾癌的定性、定位诊断方面有着良好的应用前景。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

第一部分人肾癌相关抗原G250蛋白的克隆、表达和纯化

1.材料和方法

2.结果

3讨论

4小结

第二部分 G250单克隆抗体的制备与初步鉴定

1 材料和方法

3结果

4讨论

5小结

附图

第三部分放射免疫显像的初步研究

1.材料和方法

2结果

3讨论

4小结

全文总结

参考文献

附录

综述：碳酸酐酶IX（G250）与肾细胞癌相关研究进展

攻读学位期间主要成果

致谢