胸膜肺炎放线杆菌ApxII毒素的结构与功能分析及其突变体的研究

摘要

猪传染性胸膜肺炎(Porcine infectious pleuropneumonia)是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)引起的猪的一种呼吸道疾病.APP最主要的毒力因子是其分泌到细胞外的外毒素--Apx毒素.为了进一步了解该毒素的结构与功能的关系以及为拓展重组毒素蛋白的应用奠定坚实的理论基础,该实验以APP血清7型的一株现地分离株L25-4株为研究对象,利用原核表达载体pGEX-6P-1对其分泌的ApxⅡ毒素的结构基因apxⅡA在E.coli中进行了原核表达以及与表达转录后活化基因apxⅡC的APP-E.coli穿梭载体pGZRS-38进行了共表达.表达产物都以包涵体形式存在.包涵体蛋白经过洗涤、变性、复性和纯化后,使重组蛋白在体外氧化重折叠并恢复到了天然蛋白状态.通过未活化蛋白以及活化后蛋白的溶血试验,证实了活化基因apxⅡC的产物对ApxⅡ毒素溶血活性是必需的.此外,该试验还以rApxⅡ A作为免疫原免疫动物,分析了rApxⅡA的免疫原性以及对同型菌株(APP血清7型L25-4株)和异型菌株(APP血清1型4074株)攻击的免疫保护情况.结果表明,rApxⅡ A蛋白具有良好的免疫原性,作为抗原成分添加到灭活苗中后可以提高灭活苗的免疫效果,不但可以提供完全的同型保护,而且对异型菌的攻击也具有一定保护作用.自从1986年第一个基因缺失的基因工程疫苗在美国批准上市以来,基因缺失技术已成为研究病原微生物毒力基因结构与功能的关系以及构建减毒突变株的一个有效和实用的实验手段,目前已应用到许多种致病微生物的研究工作中.正是在这一时代背景下,APP也开展了基因缺失和分子致弱的相关研究.虽然在这方面国外已经取得了很多进展,但国内关于APP分子致弱的研究基础还很薄弱,所以在这方面作一些有益的探索将有助于缩小中国与其它国家的差距.该试验以APP血清7型L25-4株的apxⅡC基因为研究对象,把含有apxⅡC基因的目的片段克隆到自杀载体上,然后在体外构建apxⅡC基因的精确缺失并在缺失位点插入Ampr基因作为筛选标记,构建用于突变apxⅡC基因的转移载体pMD-ApxⅡ△CAmp.把该载体用电转化法转入APP野生型菌株中,使pMD-ApxⅡ△CAmp载体上携带的目的片段与APP染色体上的同源片段发生同源重组,这样,apxⅡC基因完全被Ampr基因所取代,从而达到将apxⅡC基因缺失和使APP分子致弱的目的.为了获得最大的电转化效率和重组效率,用APP-E.coli穿梭载体pGZRS-18对APP感受态细胞进行了预转化.在试验了不同组合的电转化参数并对转化条件进行优化后发现,当电转化参数为:电压2500v、电阻400 Ω、电容25μf、转化体系200μl、脉冲长度达6.2ms左右并进行两次脉冲时,可使pGZRS-18获得最大转化效率,此时的转化子数为138.利用APP血清7型L25-4株获得的pGZRS-18的转化子数目明显低于国外报道的同型菌株的转化子数.由此我们得出结论认为,APP血清7型L25-4株对异源DNA具有强烈的限制屏障作用.

目录

文摘

英文文摘

独创性声明及关于论文使用授权的声明

第一章引言

1 Apx毒素

1.1 Apx毒素的分子结构

1.2 Apx毒素的致病机制

1.3 Apx毒素的免疫原性

1.4 Apx毒素的研究意义

2 APP的分子致弱

2.1穿梭载体

2.2自杀载体

2.3 APP突变体的研究进展

2.4本研究的主要内容和意义

第二章Apx Ⅱ毒素的结构与功能分析

1材料和方法

1.1菌株和质粒

1.2试剂及仪器

1.3 APP基因组DNA的提取

1.4 Apx Ⅱ A的原核表达载体的构建

1.5 Apx Ⅱ A的原核表达

1.6 rApx Ⅱ A包涵体的制备、洗涤和溶解

1.7 rApx Ⅱ A的复性和纯化

1.8 rApx Ⅱ A与Apx Ⅱ C的共表达

1.9活化及未活化rApx Ⅱ A的溶血实验

1.10 GST的表达和纯化

1.11 Apx Ⅱ毒素的动物实验

2结果

2.1 Apx Ⅱ A的分子结构

2.2 Apx ⅡA基因的扩增与原核表达载体pGEX-Apx ⅡA的构建

2.3 Apx Ⅱ A的原核表达以及rApx Ⅱ A的复性和纯化

2.4 Apx Ⅱ C原核表达载体的构建

2.5 rApxⅡ A的活化及其复性和纯化

2.6活化及未活化rApxⅡ A的溶血实验

2.7 rGST的表达和纯化

2.8 rApx Ⅱ A的免疫原性

2.9 rApx Ⅱ A蛋白的动物实验

3讨论

3.1 rApx Ⅱ A的表达及其复性的影响因素

3.2 Apx Ⅱ C介导的酰基化对Apx Ⅱ A毒素溶血活性的影响

3.3 GST融合标签对rApx Ⅱ A溶血活性的影响及其意义

3.4 rApx Ⅱ A的免疫原性和交叉保护能力

第三章APP的分子致弱

1材料和方法

1.1菌株和质粒

1.2试剂及仪器

1.3 APP基因组DNA的提取

1.4 pMD-ApxⅡ △CAmp转移重组质粒的构建

1.5 pMD-ApxⅡ △CAmp转移重组质粒的大量制备及纯化

1.6 APP电转化感受态细胞的制备

1.7电转化

1.8 Apx Ⅱ C基因缺失突变株的筛选

2结果

2.1 pMD-Apx Ⅱ CA重组质粒的构建

2.2 pMD-ApxⅡ △CA重组质粒的构建

2.3 pMD-Apx Ⅱ △CAmp转移重组质粒的构建

2.4 APP-E.col i穿梭载体pGZRS-18的预转化

2.5 pMD-Apx Ⅱ △ CAmp的电转化以及ApxⅡC基因缺失突变株的筛选

3讨论

3.1为什么要插入Amp基因作为选择标记

3.2影响同源重组效率的因素

3.3影响电转化效率的因素

3.4没有筛选到突变株的可能原因

3.5今后解决办法

第四章结论

参考文献

致谢

作者简历

附图