海岛棉NBS-LRR抗性基因类似序列的分离及Gbarvin基因的鉴定

摘要

黄萎病是棉花最严重的病害之一。在棉花的栽培品种中，虽然海岛棉对黄萎病病原菌具有很好的抗性，但是很难被应用于比较感病的陆地棉品种。目前，已经从植物中分离到将近50多个针对细菌、真菌、线虫和病毒的抗病基因。虽然这些抗病基因各具特点，但是它们大多数具有保守的结构域NBS-LRR，本论文根据其保守结构域设计简并引物，以高抗黄萎病海岛棉XH21基因组DNA为模板，用PCR扩增RGAs，建立了RGAs的基因文库。对RGAs序列进行分析，有利于揭示海岛棉抗病基因的组织方式与进化、分离重要的抗病基因，进而在陆地棉的抗病育种中应用具有重要的理论和实际意义。

目录

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第一章文献综述

引言

1.1棉花与黄萎病

1.1.1棉花黄萎病病原菌

1.1.2棉花黄萎病的防治以及存在的问题

1.2植物与病原菌相互作用

1.2.1病原菌效应蛋白

1.2.2植物抗病基因

1.2.3抗病蛋白的结构

1.2.4抗病基因的分类

1.2.5 NBS-LRRR基因类似序列(RGAs)

1.2.6受体类蛋白(RLPs)

1.3病程相关(PRs)蛋白

1.3.1几丁质酶(Chitinase)与β-1，3-葡聚糖酶(β-1,3-Glucanase)

1.3.2 PR-1蛋白

1.3.3 PR-5蛋白

1.3.4防御素

1.3.5 PR-4蛋白

1.4植物抗病基因的主要克隆方法

1.4.1基于基因组变化

1.4.2基于mRNA水平

1.4.3基于蛋白质水平

1.4.4基于功能基因组

1.5植物抗病转基因的研究

1.6 RNAi(RNA interfering)作用

1.7本研究的立论依据及意义

第二章NBS-LRR基因家族基因文库的建立以及RGAs的分析

引言

2.1材料与方法

2.1.1实验材料

2.1.2 NBS-LRR保守域简并引物的设计

2.1.3棉花材料的准备

2.1.4棉花基因组DNA的提取

2.1.5 NBS-LRR RGAs的PCR扩增

2.1.6 NBS-LRR RGAs基因文库的建立

2.2结果

2.2.1 NBS-LRR RGAs的PCR扩增

2.2.2 NBS-LRR RGAs基因文库的建立及序列测定

2.3讨论

2.3.1棉花基因组DNA的提取

2.3.2 NBS-LRR RGAs的PCR扩增

2.3.3 NBS-LRR RGAs基因文库的建立与序分析

第三章棉花黄萎病菌诱导的棉花Gbarvin基因的分离

引言

3.1材料与方法

3.1.1实验材料

3.1.2 Gbarvin基因简并引物的设计

3.1.3棉花黄萎病菌的培养

3.1.4棉花材料的准备

3.1.5棉花总RNA的提取

3.1.6 mRNA的纯化

3.1.7 cDNA的合成

3.1.8 PCR扩增Gbarvin基因及克隆载体的构建

3.1.9 Gbarvin序列的测定

3.2结果

3.2.1棉花总RNA的提取

3.2.2 mRNA的纯化

3.2.3 cDNA的合成

3.2.4 PCR扩增Gbarvin基因及克隆载体的构建

3.2.5 Gbarvin基因序列的测定

3.3讨论

3.3.1 Gbarvin基因简并引物的设计

3.3.2棉花总RNA的提取

3.3.3 Gbarvin氨基酸序列分析

3.3.4 Gbarvin结构预测与功能分析

第四章Gbarvin对黄萎病病原菌的作用

引言

4.1材料与方法

4.1.1实验材料

4.1.2 Gbarvin引物的设计

4.1.3 Gbarvin基因的PCR扩增

4.1.4 Gbarvin原核表达载体的构建

4.1.5 Gbarvin的表达

4.1.6黄萎病病原菌的培养

4.1.7 Gbarvin对黄萎病病原菌生长的作用

4.1.8 Gbarvin对黄萎病病原菌孢子萌发的作用

4.2结果

4.2.1 Gbarvin基因的PCR扩增

4.2.2构建Gbarvin基因原核表达载体

4.2.3 Gbarvin的原核表达

4.2.4 Gbarvin对黄萎病病原菌生长的作用

4.2.5 Gbarvin对黄萎病病原菌孢子萌发的作用

4.3讨论

4.3.1 Gbarvin的原核表达

4.3.2 Gbarvin对黄萎病病原菌生长的作用

第五章Gbarvin基因RNAi体系的建立及转染拟南芥

引言

5.1材料与方法

5.1.1植物材料

5.1.2 RNAi载体与宿主菌

5.1.3培养基

5.1.4工具酶、分子量标准与主要化学试剂

5.1.5 Gbarvin引物的设计

5.1.6 Gbarvin基因的扩增

5.1.7 RNAi载体的构建

5.1.8植物材料的准备

5.1.9 RNAi载体浸染拟南芥

5.2结果

5.2.1 Gbarvin基因的扩增

5.2.2 RNAi载体的构建

5.2.3 RNAi载体浸染拟南芥

5.3讨论

5.3.1双生病毒RNAi载体

5.3.2 Gbarvin的RNAi

第六章Gbarvin基因转化拟南芥与烟草

引言

6.1材料与方法

6.1.1实验材料

6.1.2 Gbarvin引物的设计

6.1.3 Gbarvin基因的扩增

6.1.4 Gbarvin克隆载体的构建

6.1.5 Gbarvin植物过表达载体的构建

6.1.6过表达载体转染根瘤农杆菌

6.1.7根瘤农杆菌转化拟南芥

6.1.8根瘤农杆菌转化烟草

6.2结果

6.2.1 Gbarvin基因的扩增

6.2.2 Gbarvin克隆载体的构建

6.2.3 Gbarvin植物过表达载体的构建

6.3讨论

6.3.1根瘤农杆菌的转染

6.2.3根瘤农杆菌转化拟南芥

6.2.3根瘤农杆菌转化烟草

第七章结论

参考文献

致谢

附录