利用T-DNA插入突变和RNA干涉技术研究水稻基因功能

摘要

本研究利用T-DNA插入突变和RNA干涉技术创制水稻突变体，并根据突变体的表型来研究相应基因的功能和表达模式。　　本研究是中国高技术研究发展计划项目“水稻突变体库的创制与功能基因组学研究”和国家自然科学基金项目“水稻受体激酶功能及其与环境信号分子的作用”的一部分，通过与合作者的共同努力，取得了以下主要研究进展：　　建立了一套高效快速的根癌农杆菌介导的水稻遗传转化程序，从诱导成熟胚来源的愈伤组织开始，约90d后即可得到转化植株。评估了GAL4/VP16-UAS-GUS增强子捕获系统在水稻中的效率。　　利用T-DNA插入引入RNA干涉系统的方法，对一些预测的水稻类受体激酶基因进行功能分析。通过对RNA干涉植株的筛选，发现了1个新的与稻瘟病抗性相关的类受体激酶基因(RK41)。利用Southern和Northern杂交检测从T0代RK41基因RNA干涉植株中筛选出了T-DNA为单拷贝插入且RK41基因表达量明显降低的株系用于进一步的分析。对该株系的T1代RNA干涉植株和RK41基因的T0代过量表达植株进行了RT-PCR检测，结果表明抑制RK41基因的表达后，水稻对稻瘟菌(Magnaporthegrisea)的敏感性增加，而过量表达RK41基因可以增强水稻对稻瘟病的抗性，即RK41基因的表达水平和水稻的稻瘟病抗性直接相关。

目录

文摘

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第一章文献综述

1.1水稻基因组学研究概述

1.2水稻T-DNA插入突变技术研究进展

1.2.1 T-DNA插入与基因敲除

1.2.2 T-DNA激活标签技术

1.2.3 T-DNA捕获标签技术

1.2.4 T-DNA插入位点侧翼序列的分离

1.3 RNA干涉技术研究进展

1.3.1 RNA干涉的作用机制

1.3.2 RNA干涉的参与因子

1.3.3 RNA干涉的功能和意义

1.3.4 RNA干涉技术的特点和方法

1.3.5 RNA干涉技术在植物中的应用

1.4植物类受体激酶基因研究进展

1.5本研究的意义和技术路线

第二章利用T-DNA插入构建水稻增强子捕获突变群体

2.1材料与方法

2.1.1水稻转化所用双元载体

2.1.2水稻材料和成熟胚来源的愈伤组织诱导

2.1.3胚性愈伤组织的转化

2.1.4潮霉素抗性愈伤组织筛选和植株再生

2.1.5再生植株的PCR和Southern杂交检测

2.2结果

2.2.1水稻遗传转化的效率及其影响因素

2.2.2再生植株的PCR和Southern杂交检测

2.3讨论

第三章水稻增强子捕获突变群体的功能分析

3.1材料与方法

3.1.1 GAL4/VP16-UAS-GUS系统的增强子捕获功能

3.1.2水稻组织的GUS组织化学染色

3.1.3 T-DNA插入位点侧翼序列的分离

3.1.4侧翼序列的测定

3.1.5侧翼序列的同源性查找和启动子预测

3.1.6预测启动子的功能分析

3.2结果

3.2.1 T1代种子和幼苗中GUS基因的表达模式

3.2.2 T-DNA侧翼序列的扩增

3.2.3 T-DNA侧翼序列的结构分析

3.2.4 T-DNA插入位点的分析

3.2.5启动子的预测和表达模式分析

3.2.6 T-DNA插入与GUS染色表型的共分离分析

3.3讨论

第四章水稻类受体激酶基因的RNA干涉分析

4.1材料与方法

4.1.1水稻用RNA干涉诱导载体和基因过量表达载体的构建

4.1.2类受体激酶基因RNA干涉、过量表达和启动子检测载体的构建

4.1.3稻瘟菌接种

4.1.4 Southern杂交

4.1.5 Northern杂交

4.1.6 RT-PCR检测

4.2结果

4.2.1水稻用RNA干涉诱导载体和基因过量表达载体的构建

4.2.2类受体激酶基因RNA干涉载体的构建

4.2.3稻瘟菌筛选RNA干涉突变体及相应LRR-RLK基因的结构分析

4.2.4 RK41基因T0代RNA干涉植株的Southern和Northern检测

4.2.5 RK41基因T1代RNA干涉植株的RT-PCR和抗瘟性检测

4.2.6 RK41基因过量表达载体的构建

4.2.7 RK41基因过量表达植株的RT-PCR和抗瘟性检测

4.2.8 RK41基因表达模式的检测

4.2.9其它LRR-RLK基因的RNA干涉突变体

4.3讨论

结论及创新点

参考文献

致谢

作者简历