柠条锦鸡儿苯丙氨酸解氨酶（PAL）基因的克隆、RNAi载体构建和相关功能分析

摘要

本论文以柠条锦鸡儿为实验材料，以木质素合成关键酶PAL为对象，进行了酶的纯化、酶活性的时空差异、编码基因的时空表达、编码基因片段的克隆、RNAi载体构建及RNAi序列对靶酶的调控效应等方面的研究工作。 实验结果表明：柠条干种子中存在微弱的PAL活性，当种子开始萌动后PAL活性迅速增加，活性比干种子增加近4倍，比活增加5倍多。从萌芽期到硬化期，在实验样品的根、茎、叶及相应器官中PAL活性和比活均呈现出小－大－小的类抛物线变化。叶器官中PAL活性从子叶期到速生期迅速增加，真叶期比子叶期增加2.2倍，速生期达到最大，比真叶期增加1.33倍。而硬化期活性降低，硬化期比速生期活性降低21％；茎中PAL活性从子叶期到速生期迅速增加，真叶期比子叶期增加1.48倍，速生期达到最大，比真叶期增加1.25倍。硬化期时活性大大降低，仅为速生期活性的48％；而根中PAL活性在真叶期达到最大，真叶期后活性降低，速生期、硬化期的活性分别为真叶期活性的49％和17％。各器官中PAL比活变化与活性变化基本相似。 速生期叶片中的PAL，经DEAE52离子交换层析分离，可以得到2个活性峰，分别在盐离子浓度约为0.4M和0.75M时出现。速生期茎中和真叶期根中的PAL，经DE52离子交换层析分离，均得到1个活性峰，在盐离子浓度约为0.4M时出现。分子筛层析表明：DEAE52中分离到的活性峰均为单一活性峰组分，0.4M盐离子洗脱峰分子量约为222KD；0.75M盐离子洗脱峰分子量约为306KD。SDS-PAGE结果表明：分子量为222KD的PAL全酶是由单一亚基组成的多聚体，亚基分子量为74KD；分子量为306KD的PAL全酶是由2种亚基组成的多聚体，亚基分子量分别为74KD和82KD。 以18SrRNA片段为内标探针，进行的半定量Northern杂交表明：柠条的不同器官和不同发育阶段，pal有不同的表达量。柠条存在2类pal编码基因，碱基数较少的b基因存在于所有样本中，而碱基数较多的a基因仅存在于叶片中。根部器官中palb基因的表达以子叶期为最高，分别约为真叶期、速生期和硬化期的1.24、1.94和5.17倍。茎中该基因以真叶期为最高，分别约为子叶期、速生期和硬化期的2.85、4.61和5.11倍。叶中该基因以真叶期为最高，分别约为子叶期、速生期和硬化期的2.69、3.56和4.48倍。仅存在于柠条叶中的pala基因表达量变化趋势与b基因相似，以真叶期为最高，分别是子叶期、速生期和硬化期的2.82、1.93和2.38倍；但(1)a基因表达量差异比器官中b基因间的差异小；(2)a基因的表达量比同期b基因的表达量低，a基因的表达量与同期pal总表达量的比值随发育而升高。 对用TRIZOL法提取的真叶期、速生期、硬化期茎的RNA，进行了质量分析，结果表明：所提RNA样品中OD260/OD280均超过1.9；在电泳条带上28S/18S均超过2。 根据以DNA为模板扩增出的pal序列设计一对特异引物，以pal表达量最高的真叶期茎RNA为模板，利用RT-PCR进行扩增。扩增片段回收后连接到pGEM-T-Easy载体中，对T载体中插入的pal片段测序，对序列进行读码分析，登陆NCBI进行同源性比对，用DNAMAN软件与DNA为模板得出的序列进行相似性分析。测序结果表明，RT-PCR扩增出的pal片段大小为564bp，可连续编码188个氨基酸。同源性分析表明：该序列与同区段的Trifoliumsubterran、M.Sative、Manihotesculenta和Phaseolusvulgaris的同源性分别为90.78％、92.9％、85.11％和89.72％。该基因片段与DNA为模板扩增出的片段相比，在5个位点存在碱基差异。 以pal片段为模板，2对带不同酶切位点的pal序列为特异引物进行PCR扩增，以pBluescript为原始载体，经多次亚克隆操作，将来自pHellsgate8的intron和2个扩增的pal片段插入pCAMBIA2300中，插入方式为2个pal扩增片段反向插入到intron两侧。构建成pal相关的RNAi载体palRNAiq。 以农杆菌LBA4404为受体菌，将palRNAiq转化农杆菌，采用叶盘法，将农杆菌载体转化到模式植物烟草中。通过卡那对转基因烟草进行初筛，对初筛的转基因烟草，以intron两侧带不同酶切位点的pal3’序列为一对引物，进行PCR扩增，检测转基因植株。以带地高辛标记的intron序列为探针，进行转基因植株的PCR-Southern杂交、以带地高辛标记的CaMV35S启动子序列为探针，通过对转基因植株的基因组DNA和单酶切基因组DNA的Southern杂交进行转基因株验证。结果表明：任取10个阳性株进行外源基因验证时，有3株为假阳性。单酶切基因组DNA的Southern杂交结果还表明在检测出的7株转palRNAi载体的烟草中，外源基因已整合到转基因烟草的染色体DNA中，但不同转基因植株中外源基因有不同插入位点和不同的拷贝数。 以带地高辛标记的pal序列为探针，以18SrRNA为内标，进行转基因烟草的Northern杂交实验，结果发现：在转palRNAi载体的转基因烟草中，pal基因表达量受抑制，不同转基因植株中，pal表达的被抑制程度不同，范围从37-67％不等。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略表

独创性声明及关于论文使用授权的声明

第一章绪论

1.1木质素调控研究进展

1.2植物基因克隆的方法与策略

1.3苯丙氨酸解氨酶(PAL)的研究进展

1.4 RNA干扰研究进展

1.5柠条

1.6本研究的目的意义和选题依据

1.7主要研究内容

第二章柠条锦鸡儿DNA的提取及PAL基因引物的设计

第三章柠条锦鸡儿苯丙氨酸解氨酶的活性测定以及分离纯化

第四章柠条锦鸡儿发育中苯丙氨酸解氨酶基因表达的研究

第五章柠条锦鸡儿苯丙氨酸解氨酶cDNA片段的克隆与序列分析

第六章RNAi表达载体构建

第七章RNAi表达载体的转化、农杆菌侵染及转基因植株检测鉴定

第八章结论

附录

参考文献

致谢

作者简历