木质素合成调控及其与甘蓝型油菜抗菌核病和抗倒伏性关系研究

摘要

本文首先分析了不同油菜材料木质素含量及其与油菜抗菌核病和抗倒伏性之间的相关关系，为利用基因工程技术提高油菜木质素含量，增强其抗菌核病和抗倒伏能力提供依据。利用同源序列法从毛白杨中分离4-CL基因，并对其生化功能进行验证，进而通过异源4-CL基因在甘蓝型油菜(Brassicanapus)中的过量表达，研究4-CL活性水平的调控对油菜木质素含量及抗菌核病和抗倒伏能力的影响，为油菜高产、优质、抗逆育种奠定基础，并为作物抗病和抗倒伏研究及育种提供新的思路和方法。本文的另一个研究内容是选用特异抗菌核病、抗倒伏和特异不抗菌核病、不抗倒伏的油菜材料配制杂交组合，利用共显性标记SSR和基于功能基因外显子的SRAP标记对甘蓝型油菜抗菌核病和抗倒伏性进行QTL定位研究，筛选对油菜抗菌核病和抗倒伏性状具有显著作用的QTL位点，为下一步QTLs的分离和基因聚合创造条件。主要如下结果：　　1.分析了29个油菜材料茎杆木质素含量与抗菌核病和茎杆强度之间的相关关系，其相关系数分别为0.6971和0.618，表明木质素含量与油菜抗菌核病和抗倒伏之间存在显著正相关性。 2.从毛白杨木质化茎中分离了一个4-CLcDNA，序列分析表明，该cDNA包含翻译起始密码子和终止密码子及完整的编码框序列(ORF)。推导氨基酸序列分析表明，该cDNA编码蛋白序列中包含所有已知4-CL蛋白的两个特征序列boxⅠ(SSGTTGLPKGV)和boxⅡ(GEICIRG)。进化分析表明，该蛋白为classⅠ4-CL蛋白，且在进化上与白杨(Populustremuloides)中参与木质素合成的4-CL1(AF041049)最为相近。 3.构建了原核表达载体pETL，利用E.coli表达了含N-末端多聚组氨酸(HiS×6)标签的4-CL重组蛋白。活性分析表明，所表达的重组蛋白具有生物学活性，能够催化参与木质素合成的三种底物PA、CA、FA的活化，底物偏爱性顺序为PA＞FA＞CA。重组蛋白对SA则没有活性。 4.利用Ni2+亲和柱纯化了带HiS×6标签的4-CL重组蛋白，以纯化蛋白作为抗原，制备4-CL抗血清，为下一步转基因植株的Westernblotting检测奠定基础。 5.构建了植物表达载体pBI121:4CL和pBI-C4H:4CL，并转化甘蓝型油菜品种中双9号和37301，共获得56棵抗Kan转基因植株，其中51株来自37301，包括转pBI121:4CL植株12棵和转pBI-C4H:4CL植株39棵。由中双9号获得的抗Kan植株共5棵，包括转pBI121:4CL植株2棵，转pBI-C4H:4CL植株3棵。 6.PCR检测表明转基因植株阳性率为60％左右，Southernblotting分析表明，外源基因已整合到油菜基因组中。 7.Westernblotting检测表明，在部分转基因植株中外源基因获得表达。与对照相比，转基因植株的木质素含量、抗菌核病和抗倒伏能力均明显提高。同时也有少数植株表现出基因沉默现象。 8.构建了中双9号×37301的F2：3群体，利用SRAP和SSR标记进行遗传作图，得到一张包含22个连锁群的遗传图谱，图谱总长度为1235.3cM，标记间平均距离为8.76cM。 9.对甘蓝型油菜菌核病抗性进行QTL定位分析(由于大风未获得抗倒伏性结果)。在荆州点筛选到3个与抗病性有关的QTL位点，分别定位在第4、15、21连锁群上，共解释34.54％的表型变异。在新洲点检测到4个QTLs，分别定位在第3、13、15、21连锁群上，共解释36.19％的表型变异。两地共同检测到的QTL位点为r15和r21，它们共解释的变异方差分别为27.29％(荆州点)和23.48％(新洲点)。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略表

独创性声明及关于论文使用授权的声明

第一章前言

第二章木质素含量与油菜抗菌核病和抗倒伏性相关关系分析

第三章毛白杨4-CL cDNA的克隆及序列分析

第四章 4-CL基因的表达、活性分析及抗体制备

第五章 4-CL基因在甘蓝型油菜中的转化

第六章甘蓝型油菜抗菌核病QTL定位分析

第七章讨论与总结

参考文献

附录

致谢

作者简历