坏死梭杆菌保护性抗原确定与基因筛选研究

摘要

本项研究建立了坏死梭杆菌FN(A)P2001小鼠感染模型，对坏死梭杆菌免疫原及保护性抗原进行了筛选研究，通过对保护性抗原的氨基酸序列测定和基因筛选研究，结合保护性抗原的生物学试验，确定溶血素是坏死梭杆菌的保护性抗原，是致病的主要物质。该项研究为坏死梭杆菌疫苗研制及免疫机理研究打下了基础。试验结果如下： 实验将鹿源坏死梭杆菌FN(A)p2001分离株以不同菌量，不同途径接种于小鼠，逐日观察小鼠感染情况，死亡小鼠进行病理学检查和细菌分离鉴定。结果表明，坏死梭杆菌FN(A)P2001分离株具有很强的感染毒力，对小鼠的最小致死量为106个/只菌量，腹腔接种是适宜的感染途径，从而建立了坏死梭杆菌分离株小鼠感染模型。 将坏死杆菌菌体裂解，分别将上清和沉淀制成抗原，免疫家兔制备抗血清，利用抗血清通过SDS-PAGE电泳及Western-blot技术对免疫组分进行筛选研究。回收杂交阳性的蛋白条带，分别免疫小鼠，利用对流免疫电泳检测血清抗体。结果，FN(A)型菌株的3条蛋白带和FN(AB)型菌株的1条蛋白带有免疫原性。 分别切取FN(A)型菌株和FN(AB)型菌株有免疫原性的蛋白带，免疫小鼠。用对流免疫电泳试验检测免疫效果。免疫4周后进行攻毒(107个菌/只)。结果FN(A)型菌的55KD抗原有免疫保护性。用55KD抗原免疫血清，分别与各菌株裂解抗原进行琼脂扩散试验，结果，FN(AB)型菌裂解抗原与免疫血清间无沉淀线，FN(A)型菌的5株菌与免疫血清间有沉淀线，且沉淀线末端完全融合。证明FN(A)型菌的5个菌株的抗原可产生交叉免疫反应，并具有相同的抗原决定簇。 将坏死梭杆菌FN(A)型菌的2菌株培养后离心，沉淀用灭菌去离子水稀释，加胰酶裂解菌体。菌体上清液用60％饱和度的硫酸铵盐析，沉淀经悬浮式透析装置透析，收集样品。将透析后的粗分离保护性抗原样品用凝胶层析柱分离纯化，经15％SDS-PAGE电泳及Western-blot选出目的蛋白带，转印到PVDF膜上，进行蛋白质N末端序列测定。结果2株FN(A)型坏死梭杆菌提取的保护性抗原，N端氨基酸序列基本相同(各测10个氨基酸，只有第一位不同)。经GenBank检索，在已报道的坏死梭杆菌蛋白质氨基酸序列中未发现与测序结果相同的序列。 依据测出的氨基酸序列，设计简并性引物及反向PCR引物。以简并性引物与随机引物筛选、反向PCR筛选法、以及目的基因富集筛选方法对抗原基因进行筛选。对筛选出的序列利用NCBI和EBI中的BLAST和Clustal进行氨基酸序列的同源性分析、序列比对及核苷酸序列拼接。通过对基因产物的特性分析以及功能的预测，结合生物学试验结果，确定与具核梭杆菌ATCC49256(gi27887417)溶血素具有91％同源性的基因为筛选的目的基因。

目录

文摘

英文文摘

独创性声明及关于论文使用授权的声明

第一章绪论

第二章研究内容

实验一、坏死梭杆菌毒力菌株FN(A)p2001小鼠感染模型的建立

实验二、坏死梭杆菌免疫组分筛选研究

实验三、坏死梭杆菌保护性抗原筛选及交叉免疫研究

实验四坏死梭杆菌保护性抗原分离纯化与序列测定

实验五、坏死梭杆菌保护性抗原基因的筛选研究

第三章讨论

第四章结论

参考文献

致谢

CURRICULUM VITAE

附录