甘蓝型油菜木质素单体合成基因COMT和F5H的克隆及表达调控

摘要

油菜是世界上食用植物油和植物蛋白的主要来源之一，也是我国重要的油料作物，占国内植物油料总产40％左右。菌核病和倒伏是影响油菜高产、优质的两个重要因素，而且其发生互相促进，使油菜遭受更严重危害。目前尚未发现菌核病的抗源，化学农药的使用和农业栽培措施有一定的作用，但不能根本解决菌核病和倒伏的危害，抗性品种的培育是公认最有效的方法，植物基因工程技术开辟了植物育种的广阔前景。 本研究采用同源序列法，参考Genbank中已发表的COMT基因和F5H基因序列，RT-PCR扩增高抗(耐)菌核病和抗倒伏油菜品种中双9号COMT基因和F5H基因的cDNAs，为油菜木质素合成的代谢调控奠定基础，进而分析采用反义RNA技术抑制COMT基因和F5H基因表达活性对植物产生的影响。本研究旨在利用基因工程技术，探索提高G-木质素含量，以增强植物抗(耐)病和抗倒伏能力的可行性。主要研究结果如下： 1.RT-PCR扩增得到油菜COMT基因片段，各测序片段间对应区段同源性达96％以上，与拟南芥COMT序列的同源性达92％，所翻译的氨基酸序列均包含COMT相应功能保守域，多克隆测序表明油菜COMT基因为基因家族。SOE-PCR扩增得到油菜COMT基因完整编码区段，以其中一个完整编码区段作为插入片段，采用主要在木质部特异表达的C4H启动子，构建植物反义表达载体pC4HBnC1。2.RT-PCR扩增得到油菜F5H基因完整编码区段，与已发表F5H基因序列高度同源，所翻译的氨基酸序列包含相应功能保守域。多个克隆测序，发现一个与已发表F5H基因序列存在较大差异的新家族成员，表明油菜F5H基因的基因家族至少存在3个成员。以其中一个F5H基因完整编码区段作为插入片段，采用主要在木质部特异表达的C4H启动子，构建植物反义表达载体pC4HBnF5。 3.对SOE-PCR扩增得到油菜COMT基因完整编码区段和RT-PCR扩增得到油菜F5H基因完整编码区段的各3个克隆进行原核表达，SDS-PAGE检测，均得到与预测结果一致的融合蛋白。 4.叶盘法转化烟草，获得多个T0代转反义F5H基因株系。在开花前，转基因株系和空白对照生长发育情况大致相同；进入生殖生长阶段后，转基因烟草株系的茎杆较细，叶片较小，总体表现为长势单薄，开花结实较差；收获种子后挖掘根系，绝大多数转基因烟草株系表现为须根发育极少而有明显的主根，空白对照为繁茂的须根而无明显的主根。 在开花结实阶段，选择生长发育情况一致的烟草植株，冰冻超薄切片，进行组织化学染色。Wiesner反应和Maüle反应的结果初步说明，茎秆木质素的沉淀分布发生了变化。 5.以子叶柄为受体，农杆菌介导转化甘蓝型油菜，获得T0代转反义F5H基因油菜株系1个。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略表

独创性声明及关于论文使用授权的声明

第一章前言

第二章甘蓝型油菜COMT和F5H基因的克隆

第三章甘蓝型油菜COMT和F5H基因的原核表达

第四章反义F5H在烟草中的表达

第五章反义F5H在甘蓝型油菜中的转化

第六章讨论与总结

参考文献

致谢

作者简历