砀山酥梨果实木质素合成关键酶基因COMT的克隆和表达分析

摘要

砀山酥梨(Pyrus bretschneideri cv.Dangshan Su)原产安徽省砀山县，栽培历史悠久，是我国主要的梨出口品种。近几年来，由于气候变化、栽培管理粗放等原因，梨果实中石细胞含量增加，影响其食用品质和经济价值。梨果实中石细胞是一种厚壁组织细胞，是次生壁在初生壁上沉积形成的，与木质素的合成、转运及沉积均密切相关。咖啡酸氧甲基转移酶(COMT)是木质素合成的关键酶，主要参与S-木质素的合成。砀山酥梨果实 COMT基因的克隆，目前未见报道。因此，克隆和鉴定砀山酥梨果实中COMT基因，探讨COMT的分子特性，对利用分子生物学技术调控梨木质素的合成和石细胞的发育意义重大。
　　本研究以砀山酥梨果实为材料，克隆其 COMT cDNA全长，进行生物信息学分析，进行原核表达和实时荧光定量表达分析，另外还成功构建了真核表达载体，为后期蛋白定位和遗传转化奠定基础。主要研究结果如下：
　　1.利用RT-PCR技术并结合 RACE方法得到砀山酥梨咖啡酸氧甲基转移酶(COMT)基因的全长cDNA，命名为PbCOMT，GenBank登录号为KC905086。PbCOMT基因全长1371 bp，其开放阅读框为1098 bp，编码365个氨基酸。
　　2.生物信息学分析结果为：PbCOMT蛋白的理论分子量约为40 KD，理论等电点为5.61。PbCOMT氨基酸序列与苹果的COMT氨基酸同源性最高，相似性达94％。PbCOMT蛋白二级结构中含有34.25%α螺旋，16.44%伸展链，49.32%的无规则卷曲。 PbCOMT蛋白为疏水性蛋白，其N端无信号肽，说明该蛋白可能定位在细胞质基质中，属于非分泌性蛋白。PbCOMT蛋白的N末端有调节蛋白质二聚作用的结构域，同时也发现了催化SAM的甲基转移酶结构域。
　　3.将该基因重组到表达载体 pET-32a(+)中进行原核表达，经 IPTG诱导，SDS-PAGE检测表明，PbCOMT基因能在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，电泳检测到一条大约60 KD的外源蛋白，与预测的融合蛋白分子量相符。
　　4.实时荧光定量表达分析发现，不同发育时期(23 d，39 d，47 d，63 d和125 d)砀山酥梨果实PbCOMT基因表达量呈现先增加后下降的趋势，在63 d时达到最大表达量。花后47 dPbCOMT基因表达量，果中部＞近果核＞近果皮，并且果中部明显高于近果皮和近果核；而63 d PbCOMT基因表达量，近果核＞近果皮＞果中部。
　　5.以pCAMBIA1301-EGFP为真核载体质粒，成功构建了1301-PbCOMT-EGFP融合表达载体并进行亚细胞定位分析。

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1 文献综述

1.1梨石细胞的研究进展

1.2 木质素代谢的进展

1.3咖啡酸氧甲基转移酶的研究进展

1.4 研究意义

2 引言

3 材料与方法

3.1 实验材料

3.2 主要试剂和仪器

3.3实验设计与技术路线

3.4 实验方法

4结果与分析

4.1砀山酥梨果实总RNA的提取

4.2 PbCOMT基因全长的克隆

4.3 PbCOMT基因的生物信息学分析

4.4 PbCOMT基因的原核表达分析

4.5 PbCOMT基因的荧光定量表达分析

4.6 PbCOMT基因真核表达载体的构建及鉴定

4.7 1301-PbCOMT-EGFP的亚细胞定位

5 讨 论

5.1 PbCOMT的生物信息学分析

5.2 PbCOMT的原核表达分析

5.3 PbCOMT的荧光定量表达分析

5.4 1301-PbCOMT-EGFP的亚细胞定位分析

6结 论

参考文献

附录

致谢

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