小麦及其近缘植物NPR1类似基因和反转录转座子基因片段的分离和特性分析

摘要

本研究从白粉病菌诱导的小麦中分离到具有活性的反转录转座子，可为植物基因分离和功能鉴定提供有力的工具。取得以下研究进展： 1.根据已克隆的其它植物的NPR1基因的保守序列设计引物，从白粉病菌诱导的中间偃麦草和粗山羊草中获得了NPR1类似基因片段，具有ANK结构保守序列，这两个基因分别命名为TiNH1和AsNH2。根据获得的TiNH1基因片段的序列设计RACE引物，通过RACE法获得了TiNH1的全长基因cDNA序列，同时从粗山羊草和普通小麦分别获得了NPR1类似基因的全长序列，分别命名为AsNH1和TaNH1。对TiNH1、TaNH1、AsNH1和AsNH2的序列比较发现：TiNH1、TaNH1和AsNH1编码蛋白的氨基酸之间的同源性在98％以上，它们存在垂直同源的关系；而它们与AsNH2的同源性仅84％，说明TiNH1、TaNH1和AsNH1与AsNH2是不同类型的NPR1类似基因。由此，推测中间偃麦草和粗山羊草里可能还存在其它NPR1类似序列。 2.通过序列分析发现：TiNH1、TaNH1和AsNH1推导的蛋白质都具有已知NPR1蛋白的典型保守结构域POZ/BTB和ANK。对已报道的拟南芥、烟草、小麦、玉米的NPR1与TiNH1，TaNH1和AsNH1的氨基酸序列进行分析，结果表明：对NPR1功能起关键作用的氨基酸在不同物种不同基因产物间均具有保守性，如npr1-1(H)、npr1-2(C)和nim1-4(R)。TiNH1、TaNH1和AsNH1基因的5’端GC含量高达70％以上。进化树分析表明：TiNH1、TaNH1和AsNH1与水稻NPR1(Genbankaccession:NM189701.1)关系密切，与美国专利报道的小麦NPR1同源序列(Patentnumber：WO0070069)关系较远，说明小麦中可能存在多个NPR1或类似基因序列。 3.以TiNH1作为探针，与不同病原处理的中间偃麦草总RNA进行Northern杂交分析，结果表明：TiNH1正常情况下有微量表达，但在小麦白粉病菌(Blumeriagraminis)诱导下表达增强，以白粉病菌诱导10小时到24小时表达量最高。在小麦纹枯病菌(Rhizoctoniacerealis)诱导情况下TiNH1基因表达量也增加，纹枯病菌诱导5小时TiNH1表达水平最高，然后表达量又降低，这些结果说明：TiNH1介导对白粉病、纹枯病的抗性调控反应，TiNH1的表达模式有所不同。 4.为了解TiNH1在中间偃麦草基因组中的存在形式，以TiNH1为探针与Darl，BamHI限制内切酶消化的中间偃麦草基因组DNA进行Southern杂交分析。结果表明：TiNH1以单拷贝的形式存在于中间偃麦草基因组中。 5.利用瞬间表达技术初步分析了TiNH1基因的功能：首先构建了TiNH1基因的高效表达载体，然后使用基因枪将TiNH1基因和GUS基因的载体共轰击导入到感白粉病小麦品种中8601离体叶片表皮细胞中，用GUS基因标记阳性转化细胞。转化后4h接种白粉菌孢子，44h后观察转化阳性表皮细胞，研究TiNH1基因表达对白粉菌入侵及吸器形成产生的影响。结果表明，TiNH1在中8601叶片表皮细胞中能够瞬间表达，对白粉病菌的侵入和吸器形成均有部分抑制作用，在一定程度上增强了对白粉菌的抗性。 6.本研究探讨了小麦反转录转座子的活化模式，发现SA、JA和小麦白粉病菌防御相关的胁迫可以激活小麦反转录转座子。利用接种白粉病菌的抗病易位系小麦Pm97034的总RNA，通过RT-PCR扩增，克隆了51反转录转座子的反转录酶片段，发现3个新的小麦反转录转座子家族family8-10。Matsuoka和Tsunewaki(1996)推测小麦及其近缘属中的family4反转录转座子具有活性。为了明确family4是否具有转录活性，从family4中随意选择RT20作为探针，与用防御相关胁迫如JA、SA和病原菌处理过的Pm97034的总RNA杂交。结果表明，RT20在正常情况下有低水平的表达，但在JA、SA和病原菌诱导下，表达水平明显增强，24h处理后达到高峰，48h后恢复到正常的水平。说明family4的反转录转座子具有转录活性。Southern分析结果表明RT20以高拷贝的形式存在于小麦及其近缘属基因组中。表明了这种转录激活方式可能是小麦反转录转座子家族的共同特征。 综合上述，本研究从白粉病菌诱导的小麦及其近缘植物中分离克隆出的NPR1类似基因和小麦反转录转座子保守片段，并对它们的生物学特性和功能进行了分析。TiNH1在一定程度上增强了表达细胞对白粉病菌的抗性。从小麦及其近缘属中克隆的NPR1类似基因对揭示抗病作用机制和进行抗白粉病、纹枯病广谱抗病育种具有重要意义；具有活性的反转录转座子可为基因标签法分离基因和功能分析提供一个有力的工具。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略表

独创性声明及关于论文使用授权的声明

第一章绪论

第二章NPR1类似基因的分离、特性和功能分析

2.1材料与方法

2.2结果

2.3讨论

第三章防御相关胁迫诱导的反转录转座子特性分析

第四章全文结论

参考文献

致谢

作者简历