小麦K型细胞质雄性不育育性相关基因片段及TaLonl基因的分离与克隆

摘要

该文以小麦K型细胞质雄性不育系5418A、保持系5418B、恢复系陕229和杂交种(5418A/陕229)F<,1>为材料,用DDRT-PCR和cDNA-AFLP技术对不育系花粉育性转换期前后时期的材料的基因表达谱进行了分析.同时,通过同源克隆我们分离了小麦的TaLon1基因.该文的主要结果如下:1采用加长锚定引物和随机引物,优化了DDRT-PCR体系,提高了DDRT-PCR的稳定性;在Bachem等的基础上,改进了cDNA-AFLP的程序,酶切和连接同时进行,节省了时间.2回收了DDRT-PCR差异片段67个,cDNA-AFLP差异片段72个.小麦K型细胞质雄性不育系花粉育性转换的关键时期是二核期,因此我们用二核期的不育系、保持系和杂种F1的花粉cDNA为探针对这些差异片段进行了反向点杂交验证,得到了5条与育性相关的阳性片段.它们分别是DD59(丙酮酸脱氢酶 E1α亚基)、DD63(糖基转移酶)、AFLP49(F-box蛋白)、AFLP55(肌管素)和AFLP82(酪氨酸t-RNA合成酶基因).其中DD59、DD63和AFLP82差异片段在保持系和杂交种F1中的表达高于在不育系中的表达,而AFLP49和AFLP55差异片段在保持系和杂交种F1中的表达低于在不育系中的表达.通过电子拼接得到了小麦丙酮酸脱氢酶E1 α亚基基因的完整读码框,该基因编码一个421氨基酸的蛋白,分子量46kDa,利用PSORT软件进行预测,将其定位到小麦线粒体基质空间.3在酵母和人类中,Lon蛋白酶起着降解线粒体内的非正常蛋白质和维持线粒体基因组的稳定的重要作用.Sarria等研究表明菜豆线粒体内的CMS相关蛋白质可以被Lon蛋白酶降解.为此应用RT-PCR和RACE技术我们克隆了小麦中的Lon基因,TaLon1.RT-PCR结果表明TaLon1呈组成型表达,在不育系和可育系之间没有差异.与大肠杆菌和酵母中的Lon基因不同,对5418B幼苗42℃热激90min,TaLon1的表达没有变化.用150mM NaCl250mM NaCl处理5418B幼苗24h,TaLon1的表达量稍微下降;250mM NaCl处理5418E幼苗24h,TaLon1的表达量急剧下降.

目录

文摘

英文文摘

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第一章文献综述

1.1植物细胞质雄性不育研究进展

1.2小麦K-CMS研究进展

1.3基因差异表达研究技术

第二章利用DDRT-PCR技术分离与克隆小麦K-CMS育性相关基因片段

2.1材料与方法

2.2结果与分析

2.3讨论

第三章利用cDNA-AFLP技术分离与克隆小麦K-CMS育性相关基因片段

3.1材料与方法

3.2结果与分析

3.3讨论

第四章小麦TaLonl基因的分离与克隆

4.1材料和方法

4.2结果与分析

4.3讨论

结论

参考文献

致谢

附录

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