苏云金芽胞杆菌γ-氨基丁酸代谢旁路相关基因簇的结构与功能研究

摘要

苏云金芽胞杆菌 (Bacillus thuringiensis,简称Bt) 因其杀虫效果好、安全、高效等优点而成为农业生物防治上应用最为广泛的杀虫微生物.Bt与其它芽胞杆菌相比,一个显著特点就是在形成芽胞的同时,还能产生由杀虫蛋白组成的伴胞晶体.有关Bt伴胞晶体形成机制方面的研究主要是集中在杀虫晶体蛋白基因的表达调控上,而从代谢调控的角度研究晶体蛋白形成的分子机制目前尚未见报道.本论文围绕苏云金芽胞杆菌中与γ-氨基丁酸代谢旁路相关基因簇的结构和功能进行了一系列的研究,主要内容包括: 本研究从国内分离得到的苏云金芽胞杆菌G03菌株中克隆了gabT 和 gabD 基因,并分别在大肠杆菌中进行了表达和纯化.酶活测定结果表明,GabT和GabD蛋白分别呈现出γ-氨基丁酸转氨酶和琥珀酸半醛脱氢酶的活性.氨基酸序列同源性比对分析发现,这两个蛋白质在蜡样芽胞杆菌群(B.cereus group)中具有较高的相似性,而与枯草芽胞杆菌的相似性较低,分别为58﹪、51﹪. 利用基因敲除技术分别构建了Bt HD-73菌株的gabT、gabD基因缺失突变株,同时也构建了相应的回复突变株,对gabT、gabD基因的功能进行了研究,结果表明:gabT、gabD基因敲除不会影响突变株在丰富培养基中的正常生长,但在基础培养基(含0.2﹪GABA)中gabT基因缺失突变株的生长会受到抑制:gabT、gabD基因敲除对晶体蛋白的表达量无显著影响,但gabT的缺失会推迟晶体蛋白的表达:gabT、gabD基因敲除均会导致芽胞产量的降低;GABA代谢旁路的功能还有待于进一步了解. 通过对Bt HD-73菌株gab基因簇的克隆及序列分析发现,gab基因簇的结构与大肠杆菌和枯草芽胞杆菌的明显不同,而在蜡样芽胞杆菌群中基本上是一致的,说明γ-氨基丁酸代谢途径相关的基因簇结构在蜡样芽胞杆菌群中是比较保守的.通过RT-PCR.转录分析发现gabD和gabT基因并未同时进行转录,其中gabT单独转录,而gabD与其上游的转录激活因子编码基因reg共转录.根据克隆并测序的gab基因簇序列,分别克隆了gabT和reg基因的启动子,并构建了相应的lacZ融合表达载体.通过β-半乳糖苷酶活性的定性和定量分析,表明gabT和reg基因的转录都是由自身的启动子调控的.以上研究结果表明gabT'和gabD基因属于不同的转录单元,而gabD和reg基因组成了一个操纵子. 利用敲除载体pMADDreg通过同源重组方法敲除reg基因后获得缺失突变株HD-73(△reg).发现突变菌株的生长、产芽胞和晶体蛋白的能力与出发菌株相比并无明显差异.但reg基因的缺失严重地影响了SSADH酶活性,并通过其回复突变株恢复了SSADH酶活性,说明reg基因对gabD基因的表达起正调控作用.同样地,发现reg 基因对gabT基因的表达也起正调控作用.通过对reg基因的表达产物Reg蛋白的结构域分析,推测它可能是一种依赖丁σ<'54>因子的激活蛋白,在蜡样芽胞杆菌群中比较保守,有关其调控作用需进一步的验证. 总之,本研究为深入研究苏云金芽胞杆菌γ-氨基丁酸代谢旁路相关基因簇的结构和功能奠定了基础,也为进一步研究芽胞和伴胞晶体形成机制提供了线索.

目录

文摘

英文文摘

论文说明：插图和附表及缩略词表

绪论

1 Bt杀虫晶体蛋白

1.1形态描述

1.2生理生化机制

1.3分子生物学研究

2芽胞杆菌γ-氨基丁酸代谢旁路研究进展

2.1γ-氨基丁酸基本性质

2.2 γ-氨基丁酸的代谢调控

2.3 γ-氨基丁酸代谢途径相关的生物合成基因簇

2.4 γ-氨基丁酸代谢的表达调控机制

2.5 γ-氨基丁酸代谢途径的生理功能

3微生物功能基因组学的研究内容与方法

3.1功能基因组学的主要研究内容

3.2基因功能的研究方法

4本研究的立题依据

5本研究的目的和意义

第一章GABA Shunt相关基因的克隆、表达及同源性分析

1材料与方法

1.1实验材料

1.2研究方法

2结果与分析

2.1γ-氨基丁酸转氨酶gabT、琥珀酸半醛脱氢酶gabD基因的鉴定

2.2 γ-氨基丁酸转氨酶、琥珀酸半醛脱氢酶的表达与纯化

2.3γ-氨基丁酸转氨酶、琥珀酸半醛脱氢酶的活性检测

2.4氨基酸序列同源性分析

3讨论

4小结

第二章gabD、gabT基因缺失突变株的筛选及鉴定

1材料与方法

1.1实验材料

1.2研究方法

2结果与分析

2.1gabT基因缺失突变菌株的构建与鉴定

2.2 gabD基因缺失突变菌株的构建与鉴定

2.3 gabT、gabD基因回复突变株的构建与筛选

2.4出发菌株、突变株和回复菌株的生长特性比较

2.5突变株对晶体蛋白表达的影响

2.6突变株对芽胞形成的影响

3讨论

3.1 Bt晶体蛋白的提取

3.2利用ELISA方法测定Bt晶体蛋白的含量

4小结

第三章γ-氨基丁酸代谢途径相关基因簇的转录分析及操纵子的鉴定

1材料和方法

1.1实验材料

1.2研究方法

2结果与分析

2.1 gab gene cluster的克隆与序列分析

2.2 gab gene cluster的RT-PCR分析

2.3 gab gene cluster的启动子鉴定与融合表达分析

3讨论

3.1 γ-氨基丁酸代谢途径相关的生物合成基因簇

3.2启动子的识别与克隆方法

4小结

第四章reg基因缺失对gabT、gabD基因表达调控的影响

1材料和方法

1.1实验材料

1.2研究方法

2结果与分析

2.1 Reg蛋白质的结构及序列同源性分析

2.2敲除载体pMADDreg的构建与鉴定

2.3 reg基因缺失突变株的筛选与鉴定

2.4突变株HD-73(△reg)的功能恢复

2.5突变株的生长特性

2.6突变株产芽胞和晶体能力的分析

2.7 reg基因缺失突变对GABASE、SSADH酶活的影响

3讨论

3.1芽胞杆菌中的σ54因子

3.2 Reg转录激活因子的调控作用

4小结

第五章结论

参考文献

致谢

作者简历