欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性cDNA克隆的构建

摘要

猪繁殖与呼吸综合征(porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，PRRS)是一种以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道疾病为特征的传染病。其病原猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSvirus，PRRSV)分为两个基因型，分别是以在欧洲分离的Lelystad株(LV株)为代表的欧洲基因型(Ⅰ型)和在北美分离的VR2332株为代表的北美基因型(Ⅱ型)。PRRSV为有囊膜的单股正义RNA病毒，其基因组大小为15.5kb左右，包含9个开放阅读框，属于套式病毒目(OrderNidovirales)、动脉炎病毒科(Arteriviridae)成员。中国自1995年爆发PRRS以来，该病已经遍及全国，成为对养猪业危害最为严重的疫病之一，给养猪业带来了严重的经济损失。国内自1996年首次分离到PRRSV，已经有数株北美型PRRSV基因组全序列和部分序列发表的报道，但未见有欧洲型PRRSV流行。然而，近来国内有报道称从临床病料中通过RT-PCR方法检测到了欧洲型PRRSV的存在。 国内曾经广泛使用过欧洲型PRRSV(AMERVAC-PRRS/A3)弱毒疫苗，为了研究欧洲型弱毒疫苗株PRRSV与病料中检测出的欧洲型PRRSV的关系，应用RT-PCR方法分5段扩增了欧洲型猪繁殖与呼吸综合征(PRRSV)活疫苗AMERVAC-PRRS/A3弱毒株的全基因组，扩增产物分别克隆入pCRBluntⅡ-TOPO载体中，并测序。结果表明，该弱毒株基因组序列全长为15098bp，不包括poly(A)尾。通过该序列与相关PRRSV序列同源性比较，结果显示Ningbo42株ORF7基因(EF473137)核苷酸同源性为100％，FJ0603株NSP2基因(EF592535)核苷酸同源性为98％。我国所检测到的欧洲型PRRSVRT-PCR阳性样品很可能与欧洲型PRRSV弱毒疫苗的使用有关。 为了进一步解析欧洲型PRRSV的复制过程及调控机制，我们构建了AMERVAC-PRRS/A3株PRRSV的感染性cDNA克隆。首先将病毒基因组RNA构建成病毒全长基因组cDNA克隆，并使其置于T7原核启动子的控制之下。通过转染T7启动子启动的病毒基因组全长cDNA克隆的RNA体外转录物于敏感细胞，可使敏感细胞产生细胞病变(CPE)，并产生感染性子代病毒。拯救病毒能够稳定传代，其生长特性与亲本病毒基本一致，说明该PRRSV感染性cDNA克隆构建成功。欧洲型PRRSV感染性克隆的建立将有助于我们更好的理解PRRSV的分子机制。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略表

声明

第一章绪论

1.1猪繁殖与呼吸综合征病毒研究进展

1.1.1分类地位

1.1.2形态和理化特性

1.1.3病毒的基因组结构与病毒蛋白的功能

1.1.4致病机理及危害

1.1.5 PRRS的防治

1.2RNA病毒感染性克隆技术研究进展

1.2.1病毒感染性克隆介绍

1.2.2 RNA病毒全长感染性克隆的构建原理和策略

1.2.3 PRRSV全长感染性克隆的构建

1.2.4小结

1.3本研究的目的意义及内容

1.3.1目的意义

1.3.2研究内容

第二章欧洲型PRRSV全长基因组序列的测定及序列分析

2.1前言

2.2材料与方法

2.2.1细胞 病毒 菌株

2.2.2载体与试剂

2.2.3主要仪器

2.2.4细胞培养

2.2.5病毒纯化

2.2.6病毒RNA的提取

2.2.7引物的设计和合成

2.2.8病毒基因组cDNA的制备

2.2.9病毒基因组亚克隆片段的PCR扩增

2.2.10 PCR产物的纯化及亚克隆质粒的构建

2.2.11质粒转化感受态细胞

2.2.12重组质粒的筛选

2.2.13亚克隆质粒的酶切鉴定

2.2.14病毒基因组5'末端序列测定

2.2.15病毒基因组亚克隆片段测序

2.2.16病毒基因组cDNA全序列拼接

2.2.17病毒基因组序列分析

2.3试验结果

2.3.1病毒纯化

2.3.2病毒基因组亚克隆片段的PCR扩增结果

2.3.3亚克隆质粒的构建和鉴定

2.3.4病毒基因组5'末端序列测定

2.3.5亚克隆质粒序列测定和病毒基因组全序列拼接

2.3.6序列对比分析

2.4讨论

第三章欧洲型PRRSV感染性cDNA克隆的构建

3.1前言

3.2材料与方法

3.2.1细胞 病毒 菌株

3.2.2载体与试剂

3.2.3主要仪器

3.2.4酶切位点分析及病毒基因组全长克隆的构建

3.2.5全长克隆质粒的线性化和体外转录

3.2.6病毒拯救

3.2.7拯救病毒鉴定

3.2.8病毒的空斑形态学比较

3.2.9病毒一步生长曲线的测定

3.3试验结果

3.3.1酶切位点分析及病毒基因组全长克隆的构建

3.3.2病毒基因组全长克隆质粒的线性化和体外转录

3.3.3病毒拯救及结果鉴定

3.3.4病毒的空斑形态学比较

3.3.5病毒一步生长曲线的测定

3.4讨论

第四章结论

参考文献

附录

致谢

作者简介