一种烟草普通花叶病毒拮抗细菌活性物质的分离纯化及其作用机制研究

摘要

植物病毒病是农作物的重要病害之一。目前，抗植物病毒剂的防治效果或安全性还不理想，远远不能满足农业的需求，急需开发新型抗病毒制剂。尽管化学农药现在仍占主体，但从可持续发展的角度考虑，发展能产生高效、高活性的生物源抗病毒剂是实现产业化生物防治中的关键任务。对我国来说，微生物来源的生物化学农药是生物农药发展的主体。 1.从春季及夏季烟草的病、健叶、种子及土壤中共分离剑127个菌株，摇瓶发酵后，分别取发酵液，室内经半叶法测定其对烟草普通花叶病毒(TobaccoMosaicVirus，TMV)的拮抗作用，得到一个对TMV有很强拮抗活性的细菌菌株，根据生理生化特性和16SrDNA序列鉴定为荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)，命名为CZ，其抑病毒率可达96.73％。初步确定该菌株发酵液中的抗病毒活性物质为蛋白质，命名为CZp。并对拮抗细菌CZ产生活性物质的摇瓶发酵条件进行了初步研究。研究表明，CZ菌株适宜的摇瓶发酵条件是：NB培养基、初始pH8.0、通气量30ml/100ml、发酵温度25℃、发酵时间60h。 2.对活性蛋白CZp进行了分离纯化。利用硫酸铵分级沉淀获得粗提蛋白，并通过紫外(波长220～340nm)扫描，该物质在280nm处有紫外吸收峰，进一步确定其为蛋白类物质。发酵液经硫酸铵粗沉淀及预处理后，采用离子交换层析和分子筛层析等方法对活性物质进行了纯化，经SDS-PAGE测定其亚基的相对分子质量为13.5kD，并对其部分理化特性进行初步分析。结果表明：拮抗活性蛋白CZp稳定性较好，对酸、碱较敏感，不能忍受强酸强碱的环境条件；对温度不十分敏感，但是不能忍受长时间的持续高温；对光照不敏感，但随着光照时间的增长，活性略有下降；对蛋白酶K和胰蛋白酶均不敏感，用两种酶处理后，仍能保持原有的活性。 3.以枯斑三生烟(Nicotianatabacumvar.samsunNN)和普通烟(Nicotianatabacumvar.NC89)为寄主材料，以TMV为供试毒源，从生理生化的角度初步探索了活性蛋白CZp对TMV的作用机理，主要得到以下结果：(1)CZp具有抑制TMV在烟草体内复制增殖的能力。叶圆片法试验结果表明，研磨接种后，在CZp粗提液中悬浮的圆片比在蒸馏水中悬浮的枯斑数降低89.19％，说明CZp对病毒在烟草体内的复制增殖有一定的抑制作用。(2)CZp具有诱导寄主对TMV产生系统抗性的能力。用CZp对枯斑三生烟下部叶片进行诱导处理(清水处理作对照)，然后在其上部叶片接种TMV。结果表明，CZp可以诱导枯斑三生烟对TMV产生系统抗性，其中以诱导处理第4天的枯斑抑制率为最高，可达81.76％，枯斑出现时间推迟10h以上。(3)以CZp处理NC89烟12h后，摩擦接种TMV。第1天、5天、8天、12天、16天分别取各处理叶片测过氧化物酶(POD)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)的活性。结果发现CZp能够诱导普通烟叶片中的POD及PAL等细胞防御酶活性增强。(4)第1天、5天、8天、12天、16天分别取各处理叶片测定NC89叶片中丙二醛(MDA)和叶绿素的含量。结果表明，经CZp处理的NC89烟叶片内MDA的含量降低，而叶绿素的含量增高。 电镜观察结果表明：CZp能打破TMV粒体的规则排列，与TMV粒体不可逆的结合，从而降低其侵染能力。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略表

声明

第一章引言

1.1植物病毒病害的防治现状

1.1.1植物病毒的危害

1.1.2植物病毒病害的防治现状

1.2生物源抗病毒剂的研究

1.2.1生物源抗病毒剂的特点和研究方法

1.2.2生物源抗病毒剂的研究进展

1.3植物病害生物防治作用机制研究

1.3.1竞争作用

1.3.2寄生作用

1.3.3拮抗作用

1.3.4诱导抗性

1.3.5多方面协调作用

1.3.6其他的生防机制

1.3.7利用基因工程技术对拮抗微生物的遗传改良

第二章材料和方法

2.1实验材料

2.1.1菌株分离材料

2.1.2烟草普通花叶病毒

2.1.3烟草材料

2.1.4柱材与试剂

2.2常用培养基和溶液的配制

2.2.1常用培养基

2.2.2常用溶液的配制

2.2.3其他溶液的配制

2.3方法

2.3.1TMV侵染抑制率的计算

2.3.2拮抗菌株的分离

2.3.3拮抗TMV活性细菌的筛选

2.3.4拮抗菌鉴定

2.3.5菌株的最佳发酵条件测定

2.3.6拮抗物质的分离纯化

2.3.7抗病毒物质分子量的测定

2.3.8蛋白质浓度的测定

2.3.9拮抗物质的理化性质分析

2.3.10活性物质作用机理研究

第三章结果与分析

3.1具拮抗TMV活性的细菌菌株

3.2拮抗菌株的鉴定

3.2.1生理生化测定结果

3.2.2分子鉴定结果

3.3拮抗菌株最佳发酵条件的研究

3.3.1拮抗菌株菌体生长曲线、细菌发酵滤液对TMV的抑制率曲线及其蛋白质含量曲线的绘制

3.3.2正交组合试验测定菌株的最佳发酵条什

3.4拮抗物质的分离纯化

3.4.1细菌发酵液中活性物质的初步确定

3.4.2粗提蛋白质的离子交换层析

3.4.3蛋白质的凝胶层析

3.5拮抗物质的理化性质分析

3.5.1酸碱稳定性

3.5.2热稳定性

3.5.3光稳定性

3.5.4蛋白酶稳定性

3.6活性物质作用机理研究

3.6.1活性物质与TMV的结合方式

3.6.2活性物质对TMV的拮抗作用

3.6.3活性物质对TMV侵染的诱导抗性

第四章讨论

4.1研究菌株CZ的发酵条件

4.2活性物质的分离纯化及其特性研究

4.3 CZ对病毒病的防治是多因子综合作用的结果

4.3.1 CZp对TMV具有明显的体外钝化作用

4.3.2 CZp可明显提高烟草的抗病性

4.4 CZ的开发应用前景

参考文献

致谢

作者简历