盐草（Distichlis spicata）耐盐生理及Na转运机理研究

摘要

本研究着眼于植物耐盐性和Na+转运的研究，对盐生植物--盐草(Distichlisspicata)和甜土植物--高羊茅(Festucaarundinacea)的耐盐生理特性进行了研究，并从个体和细胞水平两个不同的研究层面测定了Na+的分布、转运，分析了各自相关的耐盐机制。 研究内容及主要结果概括如下： 1.盐草和高羊茅耐盐生理特性及抗氧化体系反应机制。实验测定了250mMNaCl处理盐草和高羊茅植株0、5、10、15、20天后，其生物量、净光合速率、细胞膜透性、脯氨酸含量以及抗氧化体系的变化。结果表明，随着盐胁迫时间的延长，盐草和高羊茅的生物量和净光合速率都小于对照，但是高羊茅下降的幅度明显大于盐草；盐胁迫导致两种参试材料叶中细胞膜透性增加，高羊茅叶中的细胞膜透性高于盐草；而脯氨酸的含量在两种参试材料中的变化并不明显；盐胁迫导致两种参试材料根组织和叶组织中SOD酶活性增高，而盐草叶组织和根组织中SOD活性高于高羊茅，说明盐草对O2.-有更高的清除效率；盐草叶组织中APX活性显著高于高羊茅，但是根组织中APX活性在两种参试材料之间差异不大，说明APX酶和SOD酶联合变化清除SOD反应产生的H2O2，而且其作用部位主要是植物的叶组织。在盐胁迫条件下，盐草叶组织中CAT酶活性显著升高，而高羊茅叶组织中CAT酶活性变化不大。 2.盐胁迫下Na+在盐草和高羊茅体内不同部位的积累和转运以及相关离子的变化。实验测定了250mMNaCl处理0、5、10、15、20、25天后，盐草和高羊茅根、茎、叶中Na+、K+、Ca2+、Mg2+离子含量变化。盐胁迫会导致盐草和高羊茅根、茎、叶中Na+含量升高，在盐胁迫15天后盐草叶中Na+含量显著低于高羊茅(P＜0.05)；两种植物叶中K+含量呈下降的趋势；在盐处理25天后，盐草叶中的K+含量高于高羊茅；而高羊茅茎和叶中的Ca2+含量高于盐草，这有利于高羊茅维持这些部位组织正常的代谢功能。通过对K+/Na+离子比的分析发现，盐草根中的K+/Na+离子比小于高羊茅，意味着更多的Na+进入到盐草的根中；而在“根-茎”和“茎-叶”的运输过程中，盐草的K+、Na+运输选择系数高于高羊茅，表明盐草对K+、Na+离子的选择运输具有很强的调控能力。 3.运用X射线电子探针研究了两种耐盐性不同的植物材料盐草和高羊茅在盐胁迫下根、茎、叶中的离子微区分布的状况及其与耐盐适应性的关系。将扫描电镜和X射线能谱仪联用，对盐胁迫20天的盐草和高羊茅不同组织部位进行了点扫描分析，测定了不同部位离子分布状况。盐胁迫下，两种植物根组织中氯离子和钠离子的相对重量都很高，但是高羊茅中柱层中的钠离子和氯离子相对重量都高于盐草；和高羊茅相反，在盐草茎中，大量的钠离子主要分布在韧皮部中，而氯离子则主要存在于木质部中；高羊茅叶组织中钠离子相对重量是盐草叶组织中2倍。说明盐草可以通过根组织对离子的选择性吸收降低进入植物体的有害离子含量，并通过离子在茎中的再次分配降低有害离子进入叶组织，从而避免对叶组织造成较大的离子毒害。显然，矿物离子在植物体内中的微区分布是耐盐机制的一个重要组成部分。 4.利用电子显微技术对盐草叶表面的盐腺结构及分布进行了观察，并研究了盐草泌盐特性的动态变化以及相关的生理生态特性，以建立植物光合作用、蒸腾速率、以及环境因子和盐草泌盐特性之间的关系。对在250mMNaCl溶液中生长了30天的盐草测定了光合速率、蒸腾速率的日变化及泌盐量的日变化，并对所分泌盐分的不同离子含量进行了测定。通过对盐草和大气相对湿度的相关性分析，发现泌盐量(Na、K、Ca、Mg)和大气湿度具有很高的相关性(R＞0.843)，而盐草在上午9:00时盐分分泌速度最大，达到61.3umolNa+g-1f.wth-1。对不同元素的分泌数量排序为：Na＞＞K＞Ca＞Mg。 5.利用分子生物学技术获得了盐草液泡膜Na+/H+antiporter基因中间片段，大约为600bp，通过序列比对发现它和其他植物的相同基因具有很高的同源性，确定为我们希望得到的目的片段。利用X-ray技术分析了盐处理0、5、10、15、20、25天后Na+在盐草细胞不同部位的积累(细胞质、液泡和细胞间质)，发现液泡和细胞间质中Na+含量明显增加，表明进入叶片中的Na+主要区隔在液泡中和控制在细胞间质中。同时测定了盐草叶组织质膜和液泡膜H+-ATPase质子泵的活性，发现盐胁迫处理使液泡膜H+-ATPase的活性显著升高，而盐草质膜H+-ATPase活性并没有明显的升高，表明细胞液泡中Na+的积累会激活液泡膜H+-ATPase质子泵的活性。 通过Real-timePCR技术检测了盐草液泡膜Na+/H+antiporter的基因表达随时间的变化，发现随着盐胁迫时间的延长，Na+/H+antiporter表达量显著升高，说明盐诱导会导致Na+/H+antiporter超量表达。 综合分析发现，随着盐胁迫时间的延长，盐草叶中增加的Na+一部分会积累到细胞液泡中形成区隔化，在区隔化的过程中液泡膜H+-ATPase质子泵的活性增强使离子转运过程的驱动力加大，同时液泡膜Na+/H+antiporter作为转运载体表达量也会协同增高。细胞间质中Na+也会增高，但是质膜H+-ATPase质子泵并没有明显变化，表明细胞可能通过控制Na+在细胞膜上的通透来抑制Na+进入到细胞质中。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略表

声明

第一章绪论

1.1研究意义

1.2国内外研究进展

1.2.1盐分对植物的伤害作用及其机理

1.2.2 Na+毒害的主要原理

1.2.3研究Na+毒害原理的方法

1.2.4植物的耐盐机理

1.2.5植物细胞对高浓度Na+的适应

1.2.6植株个体对高盐适应能力

1.3盐草耐盐性研究进展

1.4研究的问题和目标

第二章盐胁迫下盐草和高羊茅的生理适应及抗氧化体系的变化

2.1.前言

2.2材料和方法

2.2.1生物量测定

2.2.2光合速率

2.2.3耐盐生理指标测定

2.2.4抗氧化物酶活性测定

2.3结果与分析

2.3.1盐胁迫对生长及光合速率的影响

2.3.3植物对盐胁迫的生理响应

2.3.4抗氧化物酶活性变化

2.4讨论

第三章长期盐胁迫对盐草和高羊茅体内离子分布和组成的影响

3.1前言

3.2材料与方法

3.3结果与分析

3.2.1在盐草和高羊茅对Na+的吸收

3.2.2盐胁迫对于相关阳离子吸收的影响

3.2.3不同盐胁迫时间下盐草高羊毛不同组织中K+/Na+离子比的变化

3.2.4盐草和高羊茅的茎和叶中K+、Na+运输选择性系数的变化

3.3讨论

第四章盐胁迫下盐草和高羊茅离子微区分布及其与耐盐性关系

4.1前言

4.2材料和方法

4.2.1盐草不同组织部位中离子的微区分布

4.3结果与分析

4.3.1参试材料根系中离子微域分布

4.3.2.参试材料茎中离子微域分布

4.3.3参试材料叶中离子微域分布

4.4讨论

4.5结论

第五章盐草盐分分泌的日变化及其与环境因子的关系

5.1前言

5.2材料和方法

5.2.1盐草叶片形态结构的电镜观察

5.2.2光合速率和蒸腾速率测定

5.2.3泌盐量和盐分含量测定

5.3结果与分析

5.3.1盐草泌盐结构观察

5.3.1盐草泌盐结构观察

5.3.2大气环境因子的日变化

5.3.3在盐胁迫条件下盐草净光合速率和蒸腾速率的日变化

5.3.4盐草盐分分泌速率的日变化

5.3.4盐草盐腺分泌盐分的微量元素组成及速率

5.3.5盐草盐分分泌与大气湿度相关性分析

5.4讨论

第六章盐草液泡膜Na+/H+ antiporter基因中间片段的克隆

6.1前言

6.2材料与方法

6.2.1盐草的总RNA的提取

6.2.2样品总RNA逆转录

6.2.3盐草Na+/H+ antiporter基因中间片段的获得

6.2.3连接

6.2.4转化

6.2.5 DNA测序

6.3结果与分析

6.3.1 RNA的提取

6.3.2 PCR片段扩增结果

6.3.3扩增片段生物信息学分析

第七章盐草叶细胞离子区隔化及其驱动因子的协同变化

7.1前言

7.2材料和方法

7.2.1材料的培养

7.2.2利用X-ray检测盐草叶细胞中离子分布的状况

7.2.3液泡膜微囊和质膜微囊的制备

7.2.4液泡膜H+-ATPase活性测定

7.2.5质膜H+-ATPase活性测定

7.2.6液泡膜Na+/H+ antiporter基因表达实时定量PCR

7.3结果与分析

7.3.1盐草叶组织细胞中Na+的X-ray微区分析

7.3.2盐胁迫下盐草液泡膜H+-ATPase和质膜H+-ATPase活性的变化

7.3.4液泡膜Na+/H+antiporter基因表达量的变化

7.4讨论

第八章全文结论

参考文献

致 谢

作者简历