聚磷相关基因的克隆、鉴定及高效聚磷工程菌株的构建

摘要

水体的富营养化导致水质的恶化,水体功能的衰退,最终促使水体生态系统的失衡甚至崩溃,并且在自然条件下,水体富营养化是一个不可逆转和不断加速的过程。近年来水体富营养化已成为世界性的“生态癌”,在我国该问题尤为严重,由富养化引起的生态事件层出不穷。可溶性磷酸盐是导致自然水体富营养化的两大主因之一。因此如何高效、低成本的原位去除可溶性磷酸盐已经成为了全球性的研究热点。
　　 本文以实验室分离得到的中华根瘤菌NP1(Sinorhizobium ap.NP1)为原始菌株,通过同源克隆首次获得了Sinorhizobium ap.NP1中生物聚磷相关的腺苷酸激酶基因(adk)序列(登陆号:GQ249079),该基因全长579bp,编码192个氨基酸,具有完整的阅读框架。BLAST比对结果表明,NP1腺苷酸激酶与Sinorhizobium fredii NGR234腺苷酸激酶的核苷酸序列一致性为85％,氨基酸序列一致性为92％。对NP1 adk的基因产物进行了二级结构及三级结构在线模拟分析,NP1ADK的主要二级结构为α螺旋,同源比对结果表明adk基因产物的二、三级结构在不同菌株间有很高的相似性。
　　 NP1 adk基因产物不含有信号肽,结构域分析显示,NP1 ADK含有典型的Lid结构域和AMP结合结构域。
　　 以pET21b为表达载体,E.coli BL21为受体菌,进行了NP1 adk的原核表达。SDS-PAGE结果表明,NP1 adk基因的编码产物为20KDa左右,证明腺苷酸激酶获得了有效表达。HPLC对ATP定量测定结果表明:重组菌株的ATP合成量约为对照菌株的1.3倍,证明了表达产物具有生物学活性,能增强ATP的生物合成。
　　 采用组成型启动子did加强adk和ppk基因的表达,以克隆载体pBBR1MCS-3为原始载体,构建NP1 adk、ppk基因增强表达的质粒载体pBBR1MCS—DA-DP。采用电转化的方法将该质粒转入原始菌株NP1中,获得NP1重组菌株。重组菌株除磷实验表明:NP1重组菌株可有效增加可溶性磷酸盐的去除和防止再释放。重组菌株的除磷效率为NP1原始菌株的1.2倍,最高除磷率为62％；最大再释放量减少了0.21 mg／L。