抗狂犬病病毒N蛋白单克隆抗体的制备及免疫学检测方法的建立

摘要

狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒(Rabies virus,RV)引起的一种人兽共患传染病,一旦发病,死亡率几乎为100％。狂犬病呈全球性分布,每年大概有5.5万人死于该疾病。尽管在控制狂犬病方面做了很多努力,但在发展中国家,犬猫患病仍然是一个极为严重的问题。对犬猫接种狂犬疫苗后免疫效果的评价以及对狂犬病病原的诊断是防止和控制狂犬病的关键。鉴于以上现实考虑,本研究利用基因工程技术以及免疫学技术建立了狂犬病病毒抗体和抗原的检测方法,为狂犬病的防制工作的开展奠定了基础。
　　 用RT-PCR方法分别扩增山狂犬病病毒Flury LEP株N基因及其N1区域(1000-1353 bp),将二者分别克隆至原核表达载体pGEX-6P-1中,并将重组的表达载体分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,经1mmol／L IPTG诱导后进行免疫印迹分析。结果表明,重组的RV-N和RV-N1均以包涵体形式表达。与表达全长RV-N相比,RV-N1的表达量显著高于前者,且该重组蛋白同样具有良好的反应原性。用纯化的重组RV-N1作为诊断抗原建立了检测犬RV抗体的SPA-ELISA方法。通过优化反应条件,确定抗原最佳包被量是2μg／mL,血清的最佳稀释度为1:100,ProteinA-HRP的稀释度为1:4000。用建立的ELISA方法对102份临床血清样品进行检测,与商品化试剂盒相比,二者的符合率为94.1％。试验结果表明基于主要抗原表位所在区域N1蛋白的SPA-ELISA方法可有效用于犬RV抗体水平的检测,为检测RV免疫抗体的ELISA试剂盒的研制奠定了基础。
　　 将纯化后的pET-32a-RV-N蛋白免疫BALB／c小鼠,取小鼠脾脏细胞和SP2／0细胞融合后,用pGEX-6P-1-RV-N重组蛋白作为筛选抗原,经三次亚克隆筛选后得到1D9、286、3C5、685及5F2五株单克隆抗体细胞株。亚类鉴定结果表明,其中1D9、286、685三株亚类为IgG1型,3C5、5F2的亚类为IgM型。间接ELISA方法检测286单抗细胞腹水效价可达1:106。经Protein G亲和层析柱纯化和脱盐后可得到浓度为2.5 mg／mL的高纯度的单克隆抗体。免疫荧光试验结果表明五株单克隆抗体均能特异地与狂犬病病毒结合。
　　 用纯化后的pET-32a-RV-N蛋白免疫新西兰白兔,将收集的兔高免血清用Protein A亲和层析柱纯化后得到高纯度的抗狂犬病病毒N蛋白的多克隆抗体。间接ELISA测定多抗的效价可达1:2×105。用生物素标记多抗后,建立了一种“抗RV-N蛋白单抗—病原-生物素标记的兔多抗-HRP标记的亲和素”的BAB-ELISA夹心法。通过矩阵法确定了单抗的最佳包被浓度为1μg／mL,RV的最佳稀释倍数为1:2,生物素化的兔多抗的最佳稀释度为1:104,HRP标记的亲和素的最佳稀释度为1:4000。特异性试验证明,该方法不与犬细小病毒、犬瘟热病毒产生交叉反应,具有较好的特异性,为检测RV抗原奠定了基础。