牛羊梨形虫PCR-RFLP分类方法的建立及部分标志基因的克隆与测序

摘要

梨形虫是经由蜱传播的血液寄生原虫,包括泰勒虫和巴贝斯虫,在世界热带和亚热带地区广泛流行,使动物患巴贝斯虫病和泰勒虫病。牛巴贝斯虫病病原有牛巴贝斯虫、卵形巴贝斯虫、巴贝斯虫未定种、大巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫、分歧巴贝斯虫。牛泰勒虫病病原有环形泰勒虫、瑟氏泰勒虫、中华泰勒虫、小泰勒虫和突变泰勒虫。梨形虫病一般里急性过程,通常表现贫血、血红蛋白尿和黄疸。本病在世界各地流行,且死亡率高,给畜牧业和国民经济造成巨大损失.
　　 本实验利用实验室保存的梨形虫虫种,对梨形虫的标志基因(18S、Co I和cyt b)进行初步探索,并应用Co I和cyt b对巴贝斯虫和泰勒虫进行系统发育关系分析,验证几个在传统分类地位上有争议的梨形虫虫种。主要的研究内容包括以下几个方面:
　　 1.从NCBI数据库中调取梨形虫18S rRNA基因的序列,保存为FASTA格式并用CLUSTAL-X软件对序列进行比对分析,缺省参数。每一条比对的序列都在1.7Kb左右。然后,选择不同的限制性内切酶,对梨形虫18S rRNA基因的PCR扩增产物进行酶切分析。通过酶切图谱的不同而达到鉴定不同巴贝斯虫和泰勒虫虫种的目的。为梨形虫的分类和流行病学调查提供了新的方法。
　　 2.利用实验保存的梨形虫虫种,提取虫种的基因组DNA,运用PCR方法扩增梨形虫的Co I和cytb基因,经测序分析后构建系统进化树,并进行亲缘关系比较。结果显示:我国梨形虫CoI基因序列的同源性在99.6％-38.1％之间,巴贝斯虫CoI基因之间的同源性在98.90％-74.1％之间,泰勒虫Co I基因之间的同源性在98.6％-38.1％之间。其中泰勒虫Co I基因之间的差异性较巴贝斯虫大。我国梨形虫cyt b基因序列的同源性在37.2％-99.4％之间,泰勒虫之间的同源性在52.5％-99.4％之间,巴贝斯虫之间的同源性在83.8％-97.9％之间。其中巴贝斯虫之间的同源性比较高。在遗传进化关系上梨形虫和疟原虫之间的亲缘关系比较近,处于一个大的分支上；与草履虫之间的进化关系比较远,处于不同的分枝上。该结果与传统的利用18S rRNA基因序列建立的系统发育树基本符合。