锰对原代培养肉鸡肝细胞脂肪合成关键酶活性及其基因表达的影响

摘要

本论文通过3个试验,研究了不同锰水平和不同形态锰源对体外原代培养肉鸡肝脏细胞脂肪合成关键酶[脂肪酸合成酶(Fatty Acid Synthase,FAS)、苹果酸脱氢酶(MalicDehydrogenase,MDH)]活性及其基因表达的影响,从细胞及分子水平探讨了锰对肉鸡脂肪合成影响的可能作用机制。
　　 试验一旨在建立稳定、可靠的肉鸡肝细胞体外原代培养技术体系,为下一步研究锰对肉鸡肝细胞脂肪合成关键酶的影响奠定方法学基础。本试验以健康的21～24日龄的AA肉公鸡为试验动物,采用改良的原位两步灌注法分离肝脏细胞,以Leibovitz's L-15培养液为基础培养液进行体外培养。结果表明:采用改良的原位两步灌注法分离的肉鸡肝脏细胞,分散程度高,纯度好,经血细胞计数板计数,一只21～24日龄的肉仔公鸡的肝脏可以获得(2±1)×109个细胞,台盼蓝拒染法测得细胞活率均在95％以上；以Leibovitz's L-15培养液为基础培养液对肝细胞进行单层原代培养,培养7天肝细胞仍能维持正常的细胞形态,可满足后续试验的需要。
　　 试验二研究不同锰(源于无机氯化锰)水平对21～24日龄的肉公鸡原代培养肝细胞中脂肪合成关键酶活性及其基因表达的影响。本试验所用肉仔鸡从1日龄至手术前均饲喂除锰外所用营养成分均满足NRC(1994)建议的1～3周肉仔鸡营养需要量的玉米-豆粕型基础饲粮(含锰为19.69mg／kg),使试鸡处于临界缺锰状态。本研究共包括两个试验。试验1根据添加不同锰水平对肉仔鸡肝细胞乳酸脱氢酶(lactic dchydrogenase,LDH)漏山的影响,米确定培养液添加锰浓度的非毒性范围及适宜锰添加水平。试验2根据试验1的结果,在培养液中添加不同水平的锰培养肝细胞一定的时间,研究不同锰水平对原代培养的肉仔鸡肝细胞中脂肪酸合成酶活性和基因表达的影响。试验1采用单因子完全随机试验设计,在培养液中分别添加0 mM、0.02 mM、0.2 mM、0.5 mM和1 mM锰,共5个处理组,分别培养24h和48h,每个处理6个重复,每只鸡分离得到的肝细胞为一个重复。结果表明:肉仔鸡肝细胞经不同锰水平培养液分别培养24h和48h后,均显著降低了肝细胞LDH的漏出(p＜0.0001),肝细胞培养液中L,DH的活性随锰添加水平的增加呈明显的二次曲线降低,锰的适宜添加水平为0.56～0.57 mM,锰添加水平为1mM时没有对肝细胞产生毒性。试验2采用单因子完全随机试验设计,在培养液中分别添加0mM、0.25 mM、0.5 mM和0.75 mM锰,共4个处理组,分别培养24h和48h,每个处理6个重复,每只鸡分离得到的肝细胞为一个重复。结果表明:不同锰添加水平培养液培养24h对肝细胞中FAS和MDH活性及其mRNA水平均无显著影响(p＞0.24),但添加锰有降低MDHmRNA水平的趋势。不同锰添加水平培养液培养48h,显著降低了肝细胞中FAS和MDHmRNA水平(p＜0.001),且随着锰添加水平的增加,FAS和MDH mRNA水平有下降趋势；添加锰对FAS和MDH的活性无显著影响(p＞0.17),但添加锰有降低FAS和MDH活性的趋势。
　　 试验三研究不同水平及形态锰源对21～24日龄肉公鸡原代培养肝细胞LDH的漏出、肝细胞中脂肪合成关键酶(FAS和MDH)活性及其基因表达的影响。试鸡饲粮同试验二。试验采用2×2两因子完全随机设计,两种锰源分别为中等络合强度氨基酸锰(MnAA)和无机氯化锰,两个锰添加水平分别为0.25 mM和0.5mM,两种锰源共用一个不添加锰对照组,共组成5个处理组,各处理培养液培养肉仔鸡肝细胞48h,每个处理6个重复,每只鸡分离得到的肝细胞为一个重复。结果表明:添加锰可显著降低肝细胞[.DH的漏出、肝细胞中FAS和MDH mRNA的表达量(p＜0.0001)及FAS活性(p＜0.004):添加锰水平对肝细胞MDH mRNA的表达量(p＜0.02)有显著影响,但添加锰源以及锰源与锰水平互作对肝细胞MDH mRNA的表达量无显著影响:添加锰源、锰水平以及锰源与锰水平互作对肝细胞LDH的漏出及肝细胞中FAS mRNA的表达量均无显著影响(p＞0.13)。
　　 本论文研究结果从细胞及分子水平揭示了不同水平及形态锰对肉仔鸡肝脏中脂肪合成关键酶FAS和MDH活性及其基因表达的影响,在国内外文献中尚未见报道,是锰减少肉鸡脂肪沉积的分子机制的最新探索。该结果丰富和发展了肉鸡锰营养学的现有理论知识,对于肉鸡生产中调控其脂肪沉积有一定理论和现实指导意义。