水稻抗白叶枯病基因Xa30对应的病原菌无毒基因研究

摘要

由革兰氏阴性菌引起的水稻白叶枯病(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)是水稻生产上最严重的细菌性病害,在世界产稻国均有报道。白叶枯病菌寄主特异性强,且与水稻之间为典型的基因对基因互作关系,是分子植物病理学中研究植物与病原物互作的重要模式系统之一。根据基因对基因学说,植物抗病性常常是由来源于植物的抗病基因与相应的来源于病原物的无毒基因互作所决定的,无毒基因决定了病原菌对含有相应抗性基因的寄主植物发生特异性不亲和反应。明确Xoo致病性的分子机理对于揭示Xoo与水稻的互作机制以及制定病害防治策略具有重要的科学意义。
　　 目前,水稻黄单胞菌水稻致病变种韩国菌株KACC10331、日本菌株MAFF311018和菲律宾国际鉴别菌株PX099a的基因组序列已经公布,这为我们研究水稻白叶枯病菌与水稻的相互作用提供了良好的生物信息资源,但仍然不能够解释大批未知功能基因。Xoo突变体库的建立是开展病原菌功能基因组学研究的有效途径。本实验室前期利用Tn5转座系统构建了国际鉴别小种PX099的突变体库,库容量达24192个克隆。根据T-DNA插入基因组计算公式,插入概率达到99％,覆盖PX099基因组6倍。
　　 本实验室从我国普通野生稻中发掘、鉴定了一个编号为Y238的新抗源,经遗传分析证明其抗性是受一个新的显性基因控制,该抗病基因被命名为Xa30。利用Xa30的近等基因系CBB30I,已将其定位在水稻第11号染色体长臂上。国际鉴别小种PX099是一个毒性很强的菌株,具有广谱致病性,大多数水稻品种对其表现感病,而CBB30I对其表现抗病。为了研究抗病基因Xa30与病原菌PX099的互作机理,本研究利用近等基因系CBB30I筛选PX099突变体库,从中寻找对应CBB30I的无毒基因。主要研究结果如下:
　　 1.田间接种鉴定筛选突变体库:采用人工剪叶接种法将15540个PX099突变体菌分别接种在CBB30I植株上,每个突变体菌接种1个植株,15—18天后进行调查,经过初步筛选,共获得210个使CBB30I植株感病的突变体菌。
　　 2.突变体菌复筛鉴定；将获得的210个突变体菌在CBB30I上进一步接种,同时以感病品种IR24为对照,最终确认23个突变体菌能使CBB30I水稻品种产生不同程度的致病症状。
　　 3.分子检测Tn5插入:采用PCR和Southern bloting方法对上述23个突变菌株进行了Tn5转座子插入检测,结果表明使CBB30I抗性发生改变的突变体菌株均为转座子插入引起,只有一个突变体菌为双拷贝插入,其它均为单拷贝插入。
　　 4.Tn5插入位点左右边界基因组序列获得:利用PCR walking方法,包括基因组酶切、加入接头、二轮PCR等技术,共获得9个致病突变体菌Tn5插入位点左右边界基因组片段。
　　 5.生物信息学分析:将9个致病突变体菌左右边界的侧翼片段进行测序。测序后经Blast比对结果发现:编号XMC-103的突变体菌,Tn-5插入的基因编码假定蛋白(hypothetical protein),其下游有一基因talC6a,编码蛋白为TAL effector AvrBs3／pthA,与该基因配对的抗病基因目前还未有报道)；编号XMC-89、XMC-100、XMC-101、XMC-105、XMC-107,Tn-5插入的基因分别编码LysR家族中的转录调节蛋白(transcriptional regulator,LysR family)、分割蛋白(partitionprotein)、ATP-dependent RNA helicase、假定蛋白(hypothetical protein:其下游蛋白为two-componentsystem regulatory protein with HD-GYP domain)、肽酶(peptidase)；XMC-41、XMC-55、XMC-92,Tn5插入破坏的基因编码产物分别为青霉素酰基转移酶Ⅱ(penicillin acylaseⅡ)、马来酰乙酰乙酸异酶(maleylacetoacetate isomerase)、组氨酸激酶传感蛋白(sensor histidine kinase)的基因,推测由于Tn-5插入阻断蛋白活性,使突变体菌株表现出对水稻品种CBB30I的致病性从无毒转变为有毒。