黄瓜根结线虫取食位点早期形成相关WRKY基因的分离与分析

摘要

WRKY蛋白是一类在植物中具有重要作用的转录调控因子,其成员参与了植物的生长、发育、代谢,以及对生物或非生物胁迫应答的反应。为了确定与黄瓜根结线虫取食位点形成相关的的WRKY基因的种类及表达特性,根据黄瓜全基因组序列信息,利用生物信息学软件预测,我们在黄瓜基因组中分离和克隆了包括CsWRKY42,CsWRKY46,CsWRKY52,CsWRKY55等,总共24个与黄瓜根结发育相关的WRKY基因。主要研究结果如下:
　　 1.基于黄瓜基因组序列,通过分子生物信息学软件Glean(2.0)预测,可以初步的发现在根结形成过程中可能存在的黄瓜WRKY基因,在黄瓜基因组中共发现了57个CsWRKY基因。
　　 2.为了确定与黄瓜根结线虫取食位点早期形成相关的WRKY基因及表达特性,根据黄瓜9930的全基因组序列信息,根据57个预测到的WRKY基因,设计57对特异性引物,通过RT—PCR,在根结线虫侵染后的黄瓜根组织中共分离到24个WRKY基因,包括CsWRKY49、CsWRKY17,CsWRKY37,CsWRKY38、CsWRKY23,CsWRKY24、CsWRKY42、CsWRKY34以及编号分别为46、52、55、56、43、54、47、6、18、5、10、9、14、33、45的基因。这说明分离到的24个WRKY基因可能参与了根结线虫取食位点早期形成及根的生长发育调控。
　　 3.生物信息学分析表明,24个基因被分别定位于黄瓜的7条染色体上。系统进化树分析表明,在分离到的WRKY基因中6个为第一家族包括CsWRKY49、CsWRKY17、CsWRKY37、CsWRKY38、CsWRKY23和CsWRKY24,1个基因CsWRKY34属于第三家族,其他17个为第二家族。24个基因是对线虫的刺激反应较强烈的基因,即使在同一族中,或者亚族中,WRKY基因的表达模式有一定的差异,这可能是家族基因进化过程中功能分化所导致的结果。
　　 4.通过实时荧光定量qPCR表明,24个WRKY基因中有14个在根结线虫侵染后没有显著的变化(CsWRKY5、6、9、10、14、23、24、43、45、47、49、37、55、56),其余的10个基因表达则呈现显著的变化,其中8个基因表现为上调表达(CsWRKY18、33、34、38、42、46、48、54),2个表现为下调表达(CsWRKY17、52)。在上调表达WRKY基因中CsWRKY42的上调表达差异最最高,在12h时表达量是0h对照的16倍。研究证实黄瓜根结线虫取食位点早期形成是多个WRKY基因的复杂调控体系。