绿盲蝽刺吸胁迫诱导棉花SSH文库的构建与分析

摘要

针对Bt棉大面积种植后,棉盲蝽对棉花的为害日益严重、防治困难等现状,本文以转双价基因(Bt+CpTI)抗虫棉中棉所41和常规棉中棉所23为试验材料,应用分子生物学、生物信息学、荧光定量分析等技术方法,构建了绿盲蝽(Apolygus lucorum Meyer-Dür)刺吸胁迫诱导棉花SSH文库,对差异基因进行了半定量和荧光定量分析,明确了棉花在刺吸胁迫和非刺吸胁迫处理条件下应激基因的表达差异,且比较了抗虫棉和常规棉SSH文库ESTs的差异,本文对于深入研究棉花抗绿盲蝽机制,发掘和克隆棉花诱导防御基因,培育抗棉盲蝽的棉花品种,探求防治绿盲蝽新方法具有重要意义。本研究取得以下重要结果:
　　 1、构建了绿盲蝽刺吸胁迫常规棉(中棉所23)和抗虫棉(中棉所41)的抑制性消减杂交文库。常规棉SSH文库共获得92个有效unigene,其中正向文库中75个,反向文库中17个；抗虫棉SSH文库共获得96个有效unigene,其中正向文库中78个,反向文库中18个。
　　 2、比对了常规棉和抗虫棉Unique EST序列的相似性,常规棉SSH文库中ESTs未找到与其相似序列有60个,找到其相似序列的有32个；抗虫棉SSH文库中ESTs未找到与其相似序列有23个,找到相似序列的有73个。经对常规棉和抗虫棉SSH文库中所得差异基因进行分析,明确了绿盲蝽胁迫棉花的应激过程涉及到抗逆防御反应、能量合成代谢、信号传导与基因调控等多个生物途径,诱导表达的基因直接或间接地对绿盲蝽刺吸胁迫产生防御作用。
　　 3、利用半定量的方法分析了常规棉和抗虫棉正反向文库ESTs,筛选出8条差异显著的基因,5条为上调表达,3条为下调表达。利用荧光定量技术分析了绿盲蝽刺吸胁迫和人为机械损伤条件下PPO(多酚氧化酶)、LRR-RLK(富亮氨酸类受体蛋白激酶)、HSP70(热激蛋70)、LHCⅡ(光捕获蛋白复合物Ⅱ)等其中4个与植物抗逆性相关基因表达量的变化。在刺吸胁迫下,抗虫棉中PPO、HSP70表达量上调且变化强度大,相对表达量分别上升约1082倍和6237倍；LRR-RLK下调表达,变化量较小；LHCⅡ为下调表达,相对表达量变化明显,最低下降约188倍。常规棉中PPO没有明显变化趋势,HSP70下调表达且变化量较小；ERR-RLK为上调表达,表达量上升约134倍；IMCⅡ为下调表达,表达量变化趋势与抗虫棉(中棉所41)一致,但变化量相对较小。在人为机械损伤条件下,抗虫棉和常规棉中上述4个基因表达量均无明显变化,验证了上述4个基因与刺吸胁迫相关,而与机械损伤无明显相关性。
　　 4、对常规棉和抗虫棉正反向文库中功能确定的EST序列进行了GO分类和COG蛋白聚簇分析。GO分析发现抗虫棉正反向文库中构成的细胞组分、参与的生物过程以及分子功能作用均比常规棉正反向文库种类更多；COG蛋白聚簇分析结果表明,常规棉正反向文库的ESTs分别聚到3类和1类蛋白群体中,抗虫棉正反向文库分别聚到10类和3类蛋白群体中,表明抗虫棉SSH文库中的已知功能的ESTs蛋白功能种类更多。