鱼类肠道可定植乳酸杆菌分子生态的研究

摘要

水产养殖中使用抗生素在全球范围内受到了广泛严格地限制,从而间接促进了开发使用益生菌的研究。近年来益生菌的研究热点已经从单纯的饲喂效果分析发展为对优势菌株作用机理的解析。本研究的主要目的是评估重要经济鱼种草鱼(Ctenopharyngodon idella)、鲫鱼(Carassius gibelio)和团头鲂(Megalobrama amblycephala)肠道粘膜表面粘附的菌群结构以及环境因子对其影响,进而鉴定斑马鱼(Danio rerio)和罗非鱼肠道定植的乳酸杆菌,并分别考察强、弱定植的乳酸杆菌效果及果寡糖与抗生素等对饲喂鱼的肠道定植乳酸杆菌和总菌群的影响。
　　 首先,用16S／18S rDNA PCR-DGGE(denaturing gradient gel electrophoresis)方法调查长江下游混养鱼塘中草鱼、团头鲂和鲫鱼的鳃、体表、肠道等组织的粘附菌群结构,包括细菌、真菌以及放线菌,并与养殖水体、饲料、水草和底泥等环境因子作比较。结果发现鱼类体内微生物种类非常丰富,包括放线菌门(Actinobacteria)、蓝细菌门(Cyanobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、接合菌门(Zygomycota)、Haplosporidia、Apicomplexa、Choanozoa和一些未知菌；并且鱼鳃、体表上粘附菌群存在种间差异,粘附在体表的菌群多样性高于鳃的；肠道粘附的土著菌群与内容物含的瞬态菌有明显不同,但种间差异更大；因此鱼类的肠道菌群受环境因子的影响,但是优势菌种仍取决于肠道微环境。
　　 能否粘附在鱼类肠道肇是考察益生菌能否应用的最重要特性之一。本研究选择10株不同种的乳酸杆菌饲喂模式动物斑马鱼,基于单拷贝基因rpoB设计的引物结合PCR—DGGE技术进行定植乳酸杆菌的鉴定和半定量。结果发现饲喂的益生菌组有5株优势定植乳酸杆菌,包括布氏乳杆菌BU(L.buchneri Bu),短乳杆菌CGMCC1.2028(L.brevis CGMCC1.2028),植物乳杆菌JCM1149T(L.plantarum subsp.plantarum JCM1149T),鼠李糖乳杆菌CICC6141(L.rhamnosus CICC6141),鼠李糖乳杆菌20300(L.rhamnosus20300)。进一步用病原菌嗜水气单胞菌浸浴攻毒实验显示,其中的强定植菌株植物乳杆菌JCM1149T可以显著提升斑马鱼的免疫保护效应,适宜剂量为107 CFU／g饲料,死亡率降低了60％。
　　 利用上述混合乳酸杆菌饲喂罗非鱼2周后,鉴定出可在肠道定植且具有较高丰度的5株乳酸杆菌,但其与斑马鱼肠道定植乳酸菌谱不同,显示了乳酸杆菌定植的宿主特异性。添加果寡糖后,其表现出选择性促进乳酸杆菌增殖的效应,短乳杆菌CGMCC1.2028>鼠李糖乳杆菌CICC6141>植物乳杆菌JCM1149T。
　　 综上所述,对三种混养淡水鱼和环境微生物的考察,为全面解构淡水鱼粘附菌群提供支撑。利用基于rpoB基因的PCR—DGGE技术,快速鉴定粘附于鱼类肠道壁的乳酸杆菌,且饲喂强定植的植物乳酸杆菌JCM1149T可显著地降低嗜水气单胞菌浸浴感染斑马鱼的死亡率。而在罗非鱼肠道定植的短乳杆菌CGMCC1.2028可以被益生元果寡糖增殖,其是否适于制备合生元,值得进一步研究。