水稻AP2/EREBP转录因子基因OsASIE1抗逆功能分析

摘要

非生物胁迫是限制农作物产量增加的主要因素之一,发掘参与植物胁迫应答反应相关的基因,对于揭示植物的胁迫反应机理和利用基因工程方法培育新的作物抗逆品种具有重要意义。在长期进化过程中,植物在分子、细胞、生理和生物化学水平上发展出多种机制应对逆境胁迫,其中转录因子作为上游调控基因在植物的胁迫应答途径中扮演重要的角色。作为植物转录因子大家族之一,AP2／EREBP转录因子家族在植物发育、激素、病原反应及非生物胁迫如干旱、高盐、低温应答方面起重要作用。同时,泛素化在多种生物过程中也具有重要作用,研究表明泛素化在植物非生物胁迫应答中发挥作用。为了鉴定与水稻中与非生物胁迫抗性相关的AP2／EREBP转录因子和E3连接酶基因,本研究对本实验室非生物胁迫下的表达谱芯片数据筛选到的胁迫诱导表达的AP2／EREBP转录因子基因和E3连接酶基因进行进一步的功能验证。
　　 1.利用Real-time PCR分析了芯片分析筛选出的早胁迫下8个表达上调的AP2／EREBP转录因子基因在典型抗逆水稻中非生物胁迫前后的表达情况。结果表明大部分AP2／EREBP转录因子基因在典型抗逆水稻品种中的表达模式与胁迫敏感水稻日本晴基本相同,而且在胁迫前后的表达量和日本晴相比差异也不太显著。但是有些基因经胁迫处理后在日本晴中的表达量下降,在抗逆水稻品种中的表达量反而上升,如Os03g08470和Os07g42510经干旱处理后在日本晴中的表达量稍下降,而在抗旱品种IRAT109中表达量上升,这些基因有可能参与抗逆水稻品种特有的胁迫应答反应途径。OsASIE1经干旱、高盐、冷胁迫处理后无论是在叶片中还是在根系中表达量都增加,OsASIE1在低温、高盐和PEG胁迫下的表达量变化谱分析表明OsASIE1在干旱和高盐胁迫后表达量迅速增高且维持在较高水平,这表明OsASIE1很有可能参与水稻胁迫反应的早期应答。
　　 2.利用凝胶迁移率实验(Electrophoresis mobility shift assay,EMSA)分析了三个AP2／EREBP转录因子(Os03g08460、Os03g08470和OsASIE1)的AP2保守域能否结合干旱应答顺式作用元件DRE(dehydration-responsive element)和乙烯应答元件GCC box(Ethylene Response element),进而推断它们的功能。结果表明OsASIE1转录因子的AF2结构域能够结合DRE和GCC box序列。
　　 3.构建了三个AP2／EREBP转录因子基因(Os03g08460、Os03g08470和OsASIE1)和四个E3连接酶基因(Os07g47590、Os04g44820、Os04g01490和Os10g40490)的超表达载体以及两个AP2／EREBP转录因子基因(Os03g08460,Os03g08470)和两个E3连接酶基因(Os04g44820,Os10g40490)RNA干扰载体,并进行遗传转化,得到所有载体的水稻转基因植株。超表达转基因植株的表型鉴定表明在水稻中超表达OsASIE1能够改善水稻耐盐胁迫的能力。
　　 本研究通过一系列的实验证明AP2／EREBP转录因子OsASIE1参与水稻的高盐胁迫应答反应。推测在高盐胁迫的前期,OsASIE1的表达量迅速升高,进而通过调节下游功能基因的表达参与水稻的胁迫应答反应。OsASIE1参与水稻的非生物胁迫反应的具体分子机制还需进一步的研究。