小反刍兽疫血清抗体免疫过氧化物酶单层试验检测方法的建立

摘要

小反刍兽疫(Peste des petits ruminants，PPR)是由副粘病毒科麻疹病毒属的小反刍兽疫病毒(Pest des petits ruminants virus，PPRV)引起的一种急性、高度接触性烈性传染病，主要感染山羊和绵羊等小反刍动物。PPR自1942年在非洲被发现以来，不断向全球蔓延。2007年7月，我国首次在西藏爆发PPR疫情，2013年至2014年全国19个省区再次爆发PPR疫情，对我国养殖业造成巨大经济损失。2015年4月，在科特迪瓦首都阿比让举行的动物卫生专家会议一致同意，尝试在全球消除小反刍兽疫病毒。因此，尽快开展小反刍兽疫的病原学、流行病学、诊断与预防控制技术的综合性研究，建立快速敏感的诊断方法对PPR的防控具有深远的社会和经济意义。
　　目前针对PPRV的诊断方法较多，其中血清学检测方法主要是病毒中和试验(virusneutralization test，VNT)和竞争ELISA方法，但前者存在操作周期长，因操作活病毒而设施要求高等缺点;后者存在价格较贵、制备复杂等缺点。免疫过氧化酶单层试验(immunoperoxidasemonolayer assay，IPMA)具有快速、敏感、特异、操作简单的特点，已应用于多种病原的血清临床样本检测。但国内外还没有建立针对PPRV的IPMA检测方法，因此建立PPRV-IPMA检测方法对于PPR疫情的监测和防控具有一定的重要意义。
　　为建立针对PPR的IPMA检测方法，本研究首先建立了稳定表达山羊SLAM的BHK-21细胞系(BHK-gSLAM)。rPPRV/GFP感染该细胞系后，能复制增殖且形成明显的合胞体，而在亲本细胞上无该现象。Westem blot试验表明该细胞系能稳定表达SLAM蛋白至少20代。在细胞系建立的基础上，通过感染rPPRV/GFP制备抗原检测板，建立了IPMA检测方法，具体步骤如下:首先比较了Vero细胞和BHK-gSLAM两者在IPMA试验中的差别，结果表明，在IPMA反应板制备过程中，同等剂量的rPPRV/GFP感染Vero和BHK-gSLAM细胞，后者病变形成时间更早，并形成易于观察的合胞体;BHK-gSLAM细胞生长更紧密，形成的CPE更明显，其在AEC染色后更易于观察，因此最终选择该细胞系用于IPMA抗原检测板的制备。其次，本研究优化并确定了IPMA的最佳接毒剂量为104 TCID50/mL，病毒感染72 h后固定制备IPMA反应板，血清最佳起始稀释度为1∶10，二抗最佳工作浓度为1∶5000。最后，用该IPMA检测方法对198份羊血清（包括临床样本和PPR弱毒疫苗免疫后样本）进行检测，同时以VNT方法作为对照，结果表明，两者的符合率为95.5％。与VNT相比，IPMA的相对敏感性为91％，特异性为100％。
　　综上所述，本研究建立的IPMA方法操作简单，易于观察，检测时间仅为3小时，检测结果与VNT方法符合率较高，同时具有良好的特异性和敏感性，可以替代VNT用于PPRV免疫效果的评价和流行病学调查。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 PPRV病毒学

1．2 PPR流行病学

1．2．1 PPR的地理分布

1．2．2 PPR的危害及控制

1．3 PPRV分子生物学

1．3．1 PPRV与其他麻疹病毒属其它病毒的进化关系

1．3．2 PPRV基因组结构

1．3．3 PPRV细胞受体

1．4 PPRV诊断方法的研究进展

1．4．1 病毒分离

1．4．2 琼脂凝胶免疫扩散试验(AGID)

1．4．3 核酸探针杂交试验

1．4．4 聚合酶链式反应(PCR)

1．4．5 RT-PCR-ELISA

1．4．6 病毒中和试验(VNT)

1．4．7 基于PPRV全病毒的各种ELISA检测方法

1．4．8 血凝抑制试验(HI)

1．5 免疫过氧化物酶单层试验及在病原诊断中的应用

1．6 研究的目的和意义

第二章 试验部分

2．1 材料

2．1．1 病毒、细胞、质粒及菌株

2．1．2 主要试剂和仪器

2．2 方法

2．2．1 表达山羊SLAM的BHK-21细胞系的建立

2．2．2 IPMA反应板的制备

2．2．3 IPMA操作程序

2．2．4 IPMA结果判定标准

2．2．5 IPMA反应条件的确定

2．2．6 病毒中和试验(VNT)与IPMA对比试验

2．3 结果

2．3．1 BHK-gSLAM细胞系的建立

2．3．2 Vero细胞和BHK-gSLAM细胞IPMA试验比较

2．3．3 IPMA反应条件的确立

2．3．4 GFP表达及细胞融合在IPMA结果判定中的作用

2．3．5 病毒中和试验(VNT)和IPMA方法的比较

2．3．6 IPMA与其它病毒血清交叉试验

2．4 讨论

第三章 全文结论

参考文献

附录

致谢

作者简历