羊泰勒虫核苷酸合成代谢途径初步分析及OPRT蛋白的免疫保护试验

摘要

羊泰勒虫病是由媒介蜱传播的泰勒科泰勒属的原虫寄生于绵羊和山羊的巨噬细胞、淋巴细胞和红细胞内而引起的疾病的总称，它给全球养羊业带来了巨大的经济损失。本研究运用生物信息学初步分析了羊泰勒虫蛋白组的核酸合成代谢路径，进行了乳清酸磷酸核糖转移酶(OPRT)基因的克隆表达，以及rOPRT的绵羊保护性效果评价。其研究结果如下:
　　1.对尤氏泰勒虫、吕氏泰勒虫两个种的六个地方株的蛋白组进行核苷酸代谢途径初步分析，用COG的聚类分析结果表明，与核苷酸代谢相关的蛋白有5个，其中4个参与从头合成途径，只有一个参与补救途径。其中乳清酸磷酸核糖转移酶、腺苷酸激酶分别为从头合成途径、补救途径的关键酶，具有重要的研究意义。
　　2.克隆和表达了尤氏泰勒虫oprt基因的功能区片段，并对重组蛋白rOPRT的反应原性进行分析。结果表明oprt基因的表达产物为包涵体蛋白，rOPRT除与尤氏泰勒虫阳性血清反应外，也与吕氏泰勒虫和绵羊泰勒虫阳性血清发生交叉反应。证实oprt同源基因也存在于吕氏泰勒虫和绵羊泰勒虫。
　　3.动物保护性实验完成了rOPRT对绵羊免遭尤氏泰勒虫感染的保护效果评估。结果表明，对照组绵羊发烧持续时间明显长于免疫组，与对照组相比，免疫组绵羊带虫期明显缩短。对照组实验绵羊分别在攻虫血后第25天、26天、29天出现高虫血症，而免疫组则分别出现在第26天、32天和33天，明显比对照组出现的晚。血红蛋白含量测定的结果显示，对照组的血红蛋白含量(Hb)显著下降，而实验组Hb变化较小。同时红细胞计数和临床症状观察，可以看出对照组贫血严重且持续时间长。
　　4.用ELISA对2012年5月到2013年6月份期间采自中国21个省份、47个地区的8至20月龄绵羊和山羊的2351份血清进行了检测，对我国羊泰勒虫病的流行情况进行调查，结果表明全国各地血清学阳性率存在明显差异，如甘肃省羊的泰勒虫病血清学阳性率最高，为76％，而河北省血清学阳性率最低，未检测到羊泰勒虫感染。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 羊泰勒虫病

1．1．1 泰勒虫的生活史及病原特征

1．1．2 临床床及病理变化

1．1．3 流行特点

1．1．4 预防和治疗

1．2 羊泰勒虫诊断方法的研究进展

1．2．1 血涂片染色镜检

1．2．2 聚合酶链式反应(PCR)

1．2．3 环介导等温扩增(LAMP)

1．2．4 反向线性印记(RLB)

1．2．5 酶联免疫吸附试验(ELISA)

1．3 蛋白组学及其在寄生虫研究中的应用

1．4 泰勒虫病疫苗的研究现状

1．4．1 弱毒疫苗

1．4．2 重组亚单位疫苗

1．4．3 载体疫苗

第二章 吕氏泰勒虫与尤氏泰勒虫核苷酸合成代谢途径分析

2．1 材料

2．1．1 COG注释

2．2 方法

2．2．1 COG注释

2．3 结果

2．3．1 吕氏泰勒虫与尤氏泰勒虫核苷酸合成相关蛋白的分析

2．3．2 吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫核苷酸合成相关蛋白的定量分析

2．4 讨论

第三章 尤氏泰勒虫oprt基因的优化表达

3．1 材料

3．1．1 试验仪器

3．1．2 试验试剂

3．1．3 菌株、载体、虫体

3．1．4 实验动物

3．2 方法

3．2．1 尤氏秦勒虫的增殖

3．2．2 虫体的纯化

3．2．4 cDNA链的合成

3．2．5 引物设计

3．2．6 OPRT基因的扩增

3．2．7 胶回收

3．2．8 pGEM-T Easy载体的连接

3．2．9 转化

3．2．10 pGEM-T-OPRT质粒的提取

3．2．11 重组表达质粒pET-30a-OPRT的构建

3．2．12 pET-30a-OPRT的原核表达

3．2．13 pET-30a-OPRT表达蛋白的纯化

3．2．14 Western-blot分析

3．2．15 兔抗OPRT蛋白多抗的制备

3．3 结果

3．3．1 oprt基因的PCR扩增结果

3．3．2 尤氏泰勒虫oprt的基因序列

3．3．3 尤氏泰勒虫的氨基酸序列及生物信息学分析

3．3．4 oprt基因抗原表位分析预测

3．3．5 重组蛋白的表达及表达条件的优化

3．3．6 表达产物的Western-blot分析

3．3．7 表达产物的免疫原性分析

3．4 讨论

第四章 rOPRT动物保护性试验

4．1 材料

4．1．1 主要仪器

4．1．2 主要试剂

4．1．3 部分试剂的配制

4．1．4 寄生虫

4．1．5 实验动物

4．2 方法

4．2．1 免疫方案

4．2．2 实验羊攻虫血

4．2．3 临床症状观察

4．2．4 红细胞计数

4．2．5 血红蛋白测定

4．2．6 抗体效价的测定

4．3 结果

4．3．1 临床观察结果

4．3．2 血涂片观察结果

4．3．3 血红蛋白的测定

4．3．4 红细胞计数结果

4．3．5 抗体效价的测定

4．4 讨论

第五章 羊泰勒虫病患病率流行病学调查研究

5．1 材料

5．1．1 主要仪器

5．1．2 主要试剂

5．2 方法

5．2．1 样品的采集

5．2．2 样品的ELISA检测

5．2．3 统计学分析

5．3 结果

5．3．1 21个省的秦勒虫病患病率

5．3．2 47个地区的泰勒虫病血清学阳性率

5．3．3 统计学分析

5．4 讨论

第六章 全文结论

参考文献

致谢

作者简介