Studies on The Cell Suspension Culture and Regulation of Phenylpropanoid Metabolism of Flue——cured Tobacco

摘要

多酚类物质是烟草中重要的次生代谢物质，与烟气香气质量、安全性品质密切相关，尤其与烟叶安全性密切相关。内源多酚类物质与烟气中有害成分密切正相关，且易受生态环境因素影响。本研究以烤烟品种红花大金元和K326为材料，构建了稳定的细胞悬浮培养体系，研究了低温、盐胁迫及代谢途径关键酶专一抑制剂饲喂对多酚类物质合成代谢的调控效果，主要研究结果如下:
　　1.在无菌实验室环境下，通过无菌苗培养及转接培养无菌组培苗，以无菌组培苗幼苗叶片为外植体材料，在26±2℃暗培养，采用U6*(64)均匀设计，筛选了基于MS培养基的适宜的NAA，6-BA，2，4-D配比及浓度(3.0 mg/L NAA+2.0 mg/L6-BA+0.6mg/L2，4-D)，愈伤组织诱导率分别达到了80％(HD)和82.5％(K326)，经过3个继代培养周期后，获得了稳定的脆散性愈伤组织。轻轻捣碎愈伤组织，在悬浮细胞液体培养基（不含琼脂MS培养基）中初培养，40μm筛网过滤后的细胞团再振荡培养，培养条件为26±2℃，30g/L蔗糖为碳源，振荡转速120rpm/min，初始培养基pH5.8，每次继代培养8天，继代3次，可获得最大细胞增殖率，建立了稳定的烟草细胞悬浮培养体系，为深入研究生态环境因素对次生代谢产物的影响提供了良好的研究平台。
　　2.4℃低温处理后，香豆素含量显著增加(K326:增加了92.79％，红大:增加了54.04％)，三个关键酶活性均显著增强（K326: PAL、C4H、4CL活性分别增加了163.95％、218.83％、237.72％;红大: PAL、C4H、4CL活性分别增加了159.39％、189.36％、209.68％)，隐绿原酸含量显著下降（K326:下降了69.48％;红大:下降了53.53％），此外，低温处理对红大材料中的莨菪亭、绿原酸含量无显著影响。可见，低温处理直接提高了苯丙氨酸香4-香豆素辅酶A合成代谢通路的代谢流，提高了类黄酮类风味次生产物积累，这对同步降低烟气危害性指数及提高烟气香气质量提供了一条新的技术策略。
　　3.NaCl胁迫处理后，三个关键酶活性均显著提高（K326: PAL、C4H、4CL活性分别增加了126.29％、179.38％、202.85％;红大:PAL、C4H、4CL活性分别增加了129.24％、207.28％、240.03％），不同多酚类次生产物表现为品种间完全相反的变化趋势。其中，红大材料中，NaCl胁迫显著增加了香豆素、隐绿原酸含量，显著降低了绿原酸含量。因此，NaCl胁迫增强了红大材料中隐绿原酸合成代谢及K326材料中绿原酸合成代谢。
　　4.饲喂实验表明，PAL关键酶专一抑制剂AOA显著提高了红大材料中莨菪亭含量及K326材料中绿原酸含量（分别提高了43.29％、122.38％）。红大和K326材料中，AOA处理显著降低了PAL活性(分别降低了51.57％和35.88％)，总多酚含量分别增加了42.03％和26.03％。可见，AOA专一抑制PAL酶活处理后，香豆素合成代谢存在其他未知代谢通路。
　　5.饲喂实验表明，4CL关键酶专一抑制剂MDCA显著提高了香豆素含量（红大和K326材料分别提高了173.25％和191.87％）和绿原酸含量（红大和K326材料分别提高了18.76％和84.80％），同时显著降低了4CL活性（红大和K326材料分别降低了33.62％和32.72％），可见，MDCA专一抑制4CL酶活后，受底物香豆素反馈调节，表现为绿原酸含量的增加。

目录

声明

Abstracts

摘要

CONTENTS

Abbreviations

Chapter Ⅰ．The building of cell culture system

1．1 Introduction

2．1 Review of Literature

2．2 Standardization of culture environment

2．3 Manipulation of plant cell cultures

3．1 Materials and methods

3．2 Materials

3．3 Methods

4．1 Results

4．2 Sterile seedling cultures

4．3 The screen of callus culture condition

4．4 The screen of cell culture condition

5．Discussion

6．1 Conclusions

References

Chapter Ⅱ．The influences of external factors on phenylpropanoid metabolism

1．1 Introduction

2．1 Review of Literature

2．2The enzymes of the phenvlpropanoid pathway

2．3 Influences of Low Temperature on phenoylpropanoid metabolism

2．4 Influences of NaCl stress on phenoylpropanoid metabolism

2．5 Biochemical inhibition of the phenylpropanoid pathway enzymes

3．1 Materials and Methods

3．2 Materials

3．3 Methods

4．1 ResuRs

4．2 The influences of low temperature on phenylpropanoid metabolism

4．3 The influences of NaCl stress on phenylpropanoid metabolism

4．4 The influences of AOA on phenylpropanoid metabolism

4．5 The influences of MDCA on phenylpropanoid metabolism

5．1 Discussion

6．1 Conclusions

References

Acknowledgments

Author Biography