大眼长蝽卵黄原蛋白基因克隆、表达及应用研究

摘要

大眼长蝽Geocoris pallidipennis是一种重要的捕食性天敌昆虫，是棉花、烟草等作物害虫的主要天敌，在害虫生物防治的应用中具有广阔前景。近年来，对大眼长蝽的研究主要集中在形态特征，生活习性等生态学和捕食功能上，对其繁殖关键因子——卵黄原蛋白的研究未见报道。本文克隆了大眼长蝽卵黄原蛋白基因，研究了大眼长蝽卵黄原蛋白基因的分子特征，同时本研究表达了37KDa蛋白，明确了37KDa蛋白对大眼长蝽生长繁殖的影响，为人工饲料的改进和天敌昆虫的大规模繁殖提供了理论基础和相关技术。
　　本论文研究结果如下:
　　1.利用RT-PCR和RACE技术克隆得到了大眼长蝽卵黄原蛋白(Vg)基因全序列。该基因cDNA全长5667bp（GenBank登录号:KP688587），编码1848个氨基酸残基，N-末端的前19个氨基酸为信号肽。序列分析显示该卵黄原蛋白序列具有昆虫卵黄原蛋白所特有的保守基序和RXXR酶切位点。编码的氨基酸序列比对显示与半翅目昆虫Vg氨基酸序列相似度较高，表明克隆的cDNA序列是大眼长蝽的Vg基因序列。
　　2.ELISA检测发现随着发育时间的延长，卵黄原蛋白表达量逐渐增加，羽化后22天达到高峰，随后开始下降。本研究利用已克隆的大眼长蝽卵黄原蛋白基因序列，设计特异引物扩增目的基因片段，成功构建了Vg基因片段重组表达载体，并进一步转化寄主细胞，在不同条件下诱导Vg基因目的片段在大肠杆菌菌株中稳定表达，通过Ni-NTA柱分离纯化出目的蛋白。
　　3.研究了Vg基因编码的37KDa蛋白对大眼长蝽生长发育和繁殖的影响，明确了该蛋白在大眼长蝽中的生理功能。本研究表达的37KDa蛋白饲喂大眼长蝽结果表明:目的蛋白饲喂大眼长蝽可以显著降低其五龄发育和产卵前期，并显著提高产卵量;同时卵的孵化率与两种对照相比分别提高了18.95％和15.92％。研究结果表明37KDa蛋白具有显著促进大眼长蝽发育和繁殖的生理功能。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 大眼长蝽的生物学特性及研究现状

1．1．1 大眼长蝽的生物学特性

1．1．2 大眼长蝽的研究现状

1．2 昆虫卵黄原蛋白研究概况

1．2．1 卵黄原蛋白的结构特征

1．2．2 卵黄原蛋白的合成调控

1．2．3 卵黄原蛋白的表达研究

1．3 本研究的目的和意义

第二章 大眼长蝽卵黄原蛋白基因全长克隆

2．1 材料与方法

2．1．1 实验材料

2．1．2 主要试剂及仪器

2．1．3 试验所需溶液的制备

2．1．4 卵黄原蛋白基因克隆

2．1．5 卵黄原蛋白基因的序列分析

2．1．6 卵黄原蛋白基因进化分析

2．2 结果与分析

2．2．1 卵黄原蛋白cDNA全长克隆

2．2．2 卵黄原蛋白基因cDNA序列分析

2．2．3 卵黄原蛋白的进化分析

2．3 讨论

第三章 大眼长蝽37KDa蛋白的原核表达

3．1 材料与方法

3．1．1 实验材料

3．1．2 主要试剂及仪器

3．1．3 卵黄原蛋白在大眼长蝽中的表达分析

3．1．4 大眼长蝽37KDa蛋白序列克隆

3．1．5 大眼长蝽37KDa蛋白重组T载体的构建

3．1．6 大眼长蝽37KDa蛋白重组表达载体的构建

3．1．7 大眼长蝽37KDa蛋白的原核表达

3．1．8 SDS-PAGE电泳

3．1．9 大眼长蝽37KDa蛋白的分离纯化

3．1．10 大眼长蝽37KDa蛋白浓度的测定

3．2 结果与分析

3．2．1 ELISA法制备标准曲线

3．2．2 卵黄原蛋白在大眼长蝽中的表达量

3．2．3 大眼长蝽37KDa蛋白序列克隆

3．2．4 大眼长蝽37KDa蛋白肽表达载体的构建

3．2．5 大眼长蝽37KDa蛋白的原核表达

3．2．6 大眼长蝽37KDa蛋白的分离纯化

3．2．7 大眼长蝽37KDa蛋白浓度的测定

3．3 讨论

第四章 37KDa蛋白对大眼长蝽生物学特性的影响

4．1 材料与方法

4．1．1 实验材料

4．1．2 主要试剂及仪器

4．1．3 37KDa蛋白对大眼长蝽生长发育的影响

4．1．4 37KDa蛋白对大眼长蝽繁殖的影响

4．1．5 不同饲养条件下大眼长蝽卵黄原蛋白含量的测定

4．1．6 统计分析

4．2 结果与分析

4．2．1 37KDa蛋白对大眼长蝽生长发育的影响

4．2．2 37KDa蛋白对大眼长蝽产卵前期的影响

4．2．3 37KDa蛋白对大眼长蝽孵化率的影响

4．2．4 37KDa蛋白对大眼长蝽繁殖的影响

4．2．5 37KDa蛋白对大眼长蝽Vg基因表达量的影响

4．3 讨论

第五章 全文结论

参考文献

致谢

作者简历