层粘连蛋白受体作为猪瘟病毒吸附受体的鉴定

摘要

病毒是结构简单的微生物，无完整的代谢酶系统，需要借助宿主细胞合成自身物质从而完成自身生命周期。病毒囊膜蛋白与宿主细胞表面成分——细胞受体的相互结合则是一切病毒进入宿主细胞的起始，并决定了病毒感染的种属范围和组织嗜性。尤为重要的是，病毒囊膜蛋白与相应细胞受体的结合位点往往成为开发抗病毒药物的重要靶标。因此，针对病毒受体的研究具有重要的科研和应用价值。
　　猪瘟(Classical swine fever，CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)引起的烈性传染病。该病对养猪业危害极大，在多个国家均有流行，具有重要的经济意义。近年来，随着对CSFV研究的不断深入，研究者发现了大量与该病毒相互作用的宿主蛋白，并探讨了其机理，但针对CSFV细胞受体的研究尚属空白。迄今，仅有硫酸乙酰肝素（Heparin Sulfate，HS）被鉴定为CSFV的吸附受体。该分子亦广泛分布于CSFV非易感细胞表面，因此，推测CSFV一定存在其它尚未发现的细胞受体，并采取一系列方法筛选细胞受体。
　　本研究中，利用针对大量猪源膜蛋白基因的小分子干扰RNA来筛选可能参与CSFV感染的膜蛋白。该筛选发现了多个CSFV潜在受体分子。其中，层粘连蛋白受体(Laminin receptor，LamR)已被鉴定为多种病原体的细胞受体，选择该蛋白进行后续研究。激光共聚焦分析显示，该蛋白与CSFV在细胞膜高度共定位。免疫共沉淀试验说明该蛋白与CSFV囊膜糖蛋白Erns存在特异性相互作用。一系列抑制试验显示，抗LamR蛋白抗体、可溶性LamR和Laminin蛋白均可显著抑制CSFV的复制，并且该抑制效果呈现剂量依赖性。以表达LamR的慢病毒感染PK-15细胞，构建稳定表达LamR的细胞系。CSFV在该细胞系的复制水平显著高于对照细胞系。利用吸附试验说明LamR蛋白在CSFV吸附阶段发挥功能，LamR过表达细胞系较对照细胞系吸附病毒粒子数显著增多。进一步探讨了HS与LamR的关系，结果显示，LamR蛋白和HS互相协同，帮助病毒吸附。该现象在SK6细胞尤为明显。但LamR的表达与CSFV的组织嗜性并无明显相关性，而其被沉默后也不影响同属黄病毒科瘟病毒属的BVDV的复制。
　　综上所述，利用siRNA文库对重要的猪源膜蛋白基因进行筛选，并通过一系列抑制试验、吸附试验确定LamR为CSFV的又一吸附受体，该分子与已知受体HS相互协同，帮助CSFV感染。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 猪瘟与猪瘟病毒

1．1．1 猪瘟

1．1．2 猪瘟病毒

1．2 猪瘟病毒的复制和感染机制

1．2．1 结构蛋白在CSFV复制中的功能

1．2．2 非结构蛋白在CSFV复制中的功能

1．3 病毒的细胞受体研究进展

1．3．1 细胞受体

1．3．2 非蛋白类细胞受体的筛选方法

1．3．3 蛋白类细胞受体的筛选

1．4 猪瘟病毒及黄病毒科病毒细胞受体的研究进展

1．4．1 硫酸乙酰肝素

1．4．2 辅膜蛋白CD46

1．4．3 低密度脂蛋白受体

1．4．4 Ⅱ型膜联蛋白

1．4．5 猪瘟病毒配体的研究

1．5 层粘连蛋白受体

1．6 本研究的目的与意义

第二章 层粘连蛋白受体作为猪瘟病毒吸附受体的鉴定

2．1 材料和方法

2．1．1 毒株、细胞和载体

2．1．2 其它实验材料

2．1．3 主要仪器设备

2．1．4 试剂配制

2．1．5 siRNA分子的设计

2．1．6 干扰分子的转染和指示病毒的感染

2．1．7 Fluc活性检测

2．1．8 病毒毒价的测定

2．1．9 流式细胞术

2．1．10 慢病毒介导的稳定下调细胞系和上调细胞系的构建

2．1．11 细胞活力检测

2．1．12 激光共聚焦试验

2．1．13 细胞膜蛋白的提取

2．1．14 免疫共沉淀试验

2．1．15 阻断试验

2．1．16 可溶性蛋白竞争试验

2．1．17 Western blotting检测

2．1．18 病毒吸附试验

2．1．19 荧光定量RT-PCR

2．1．20 受体重建试验

2．1．21 适宜CSFV复制的细胞系的筛选

2．1．22 CSFV感染率的测定

2．1．24 LamR组织丰度检测

2．1．25 LamR对BVDV复制影响的检测

2．1．23 数据分析

2．2 结果

2．2．1 siRNA筛选结果

2．2．3 LamR沉默效果验证

2．2．4 沉默LamR对不同亚型CSFV复制的影响

2．2．5 CSFV在稳定下调细胞系中的复制

2，2．6 LamR与CSFV共定位情况

2．2．7 LamR与Ems的相互作用

2．2．8 可溶性LamR对CSFV复制的抑制作用

2．2．9 可溶性kaminin对CSFV复制的抑制作用

2．2．10 LamR抗体对CSFV复制的抑制作用

2．2．11 CSFV在稳定表达LamR的CSFV易感细胞中的复制

2．2．12 CSFV在稳定表达LamR的CSFV非易感细胞中的复制

2．2．13 CSFV在非易感细胞内复制水平检测

2．2．14 CSFV对细胞表面LamR的吸附能力

2．2．15 CSFV对肝素酶处理细胞的感染率

2．2．16 LamR在猪体不同器官丰度检测

2．2．17 LamR不影响BVDV的增殖

2．3 讨论

第三章 全文结论

参考文献

致谢

个人简历