亚致死剂量吡虫啉对蜜蜂脑神经细胞凋亡影响研究

摘要

蜜蜂是重要的授粉昆虫之一，却受到环境有毒有害物的侵害。新烟碱类杀虫剂是目前广泛应用的杀虫剂之一，据报道新烟碱类杀虫剂在亚致死剂量时能够引起蜜蜂幼虫中肠、卵巢和唾液腺等部位的细胞凋亡，而此类杀虫剂的作用靶标位置主要位于昆虫脑部，因而对其脑神经细胞的影响更有针对性，此方面报道较少;此外，该类杀虫剂同样影响蜜蜂的学习和记忆能力，而有关其运动能力的研究较少。有关此类杀虫剂对蜜蜂脑神经细胞凋亡的影响，结合蜜蜂爬行能力的检测，为研究此类杀虫剂对非靶标昆虫—蜜蜂的神经毒性提供一定的理论基础。
　　本实验以新烟碱类杀虫剂的代表品种吡虫啉为供试杀虫剂，以成年意大利蜜蜂为实验对象，分别从蜜蜂脑组织、细胞、亚细胞和分子水平，研究亚致死剂量吡虫啉对蜜蜂脑神经细胞凋亡的影响，并与爬行能力检测方法相结合，探求亚致死剂量吡虫啉对蜜蜂的神经毒性。具体结果如下:
　　1.在实验室水平，吡虫啉剂量为每头每天饲喂0.5、1.5和4.5 ng，分别对处理3、6、9和12d的蜜蜂进行取样，利用TUNEL法检测成年蜜蜂脑神经细胞的凋亡情况。结果显示亚致死剂量吡虫啉能够诱导蜜蜂脑神经细胞凋亡;并且细胞凋亡率随着吡虫啉剂量和处理时间的递增而增加，表现出剂量和时间效应。
　　2.在与TUNEL法实验相同处理和饲养条件下，利用Caspase-3免疫荧光法检测成年蜜蜂脑神经细胞的凋亡情况。结果显示亚致死剂量吡虫啉能够诱导蜜蜂脑神经细胞内Caspase-3蛋白的激活;并且阳性细胞率随着吡虫啉剂量和处理时间的递增而增加，表现出剂量和时间效应;并且与脑神经细胞凋亡正相关。
　　3.在与TUNEL法实验相同处理和饲养条件下，利用荧光定量法检测caspase-1基因的转录情况。结果显示亚致死剂量吡虫啉能够诱导蜜蜂脑神经细胞内caspase-1 mRNA表达量，随着吡虫啉剂量和处理时间的递增而增加，表现出剂量和时间效应。结合Caspase-3实验的结果，推测亚致死剂量吡虫啉诱导的蜜蜂脑神经细胞凋亡与Caspase依赖型凋亡途径相关。
　　4.在实验室水平，每头每天饲喂蜜蜂1.5 ng吡虫啉剂量，处理9d时，利用透射电镜法检测蜜蜂脑神经细胞超微结构的变化情况。结果显示在亚细胞水平，处理组的蜜蜂脑神经细胞与空白对照组相比存在明显的形态学变化，其中染色质凝聚并边集到核膜上、凋亡小体形成、细胞核变小等形态学变化，呈现凋亡现象，而不同于典型凋亡特征的是细胞核延迟降解;另外，自噬包括自噬泡、自噬体的出现以及线粒体、内质网和高尔基体等肿胀和发泡等现象。
　　5.在与TUNEL法实验相同处理和饲养条件下，测定了亚致死剂量吡虫啉对蜜蜂爬行能力和存活率的影响，并比较了脑细胞凋亡、爬行能力和存活率之间的关系。结果显示，在吡虫啉特定剂量和暴露时间时，虽然蜜蜂存活率无显著性差异，却能够引起蜜蜂爬行能力显著性降低;并且在相同处理条件下，在低剂量（0.5和1.5 ng）吡虫啉作用下，蜜蜂脑神经细胞凋亡率较其他两个指标（存活率和爬行能力）较早出现显著性差异。

目录

声明

英文缩略表

第一章 引言

1．1 蜜蜂的重要性

1．2 蜂群崩溃失调现象

1．3 新烟碱类杀虫剂及危害

1．3．1 新烟碱类杀虫剂概况

1．3．2 昆虫神经系统

1．3．3 新烟碱类杀虫剂对蜜蜂的危害

1．4 细胞凋亡

1．4．1 定义

1．4．2 细胞凋亡检测方法

1．4．3 细胞凋亡技术在蜜蜂领域的应用

1．5 自噬

1．6 蜜蜂行为学检测

1．7 本研究的目的意义、研究内容和技术路线

1．7．1 本研究的目的意义

1．7．2 研究内容

1．7．3 技术路线

第二章 蜜蜂脑神经细胞凋亡的TUNEL法检测

2．1 材料与方法

2．1．1 材料

2．1．2 方法

2．2 结果与分析

2．2．1 成年意蜂工蜂脑组织和脑切片

2．2．2 蜜蜂脑神经细胞群的分布

2．2．3 吡虫啉处理后意大利蜜蜂脑神经细胞凋亡率

2．3 讨论

第三章 Caspase-3活性的免疫荧光法检测

3．1 材料与方法

3．1．1 材料

3．1．2 方法

3．2 结果与分析

3．2．1 不同部位Caspase-3的阳性细胞率

3．2．2 吡虫啉处理后蜜蜂脑神经细胞Caspase-3阳性细胞率

3．3 讨论

第四章 caspase-1 mRNA表达量的测定

4．1 材料与方法

4．1．1 材料

4．1．2 方法

4．2 结果与分析

4．3 讨论

第五章 透射电镜观察蜜蜂脑神经细胞的超微结构变化

5．1 材料与方法

5．1．1 材料

5．1．2 方法

5．2 结果与分析

5．3 讨论

第六章 蜜蜂爬行能力检测

6．1 材料与方法

6．1．1 材料和仪器

6．1．2 方法

6．2 结果与分析

6．2．1 中毒后蜜蜂的症状

6．2．2 爬行行为能力的改变

6．2．3 蜜蜂幸存率

6．2．4 蜜蜂幸存率、爬行能力及凋亡率

6．3 讨论

第七章 全文结论

参考文献

致谢

作者简历