H5N1亚型禽流感病毒以巨胞饮作用侵入细胞的研究

摘要

禽流感(Avian Influenza)是由A型流感病毒(Influenza A Virus)引起的禽类传染病。根据HA和NA的抗原性，禽流感病毒分为16个HA亚型和9个NA亚型。根据毒力差异可分为高致病性禽流感病毒、低致病性禽流感病毒。自1997年高致病性禽流感(HPAI) H5N1亚型爆发以来，该病毒造成禽类的大量死亡，并且能够感染人类。如何有效地防治H5N1高致病性禽流感病毒成为研究的重点和热点。
　　为启动复制，病毒须将自身基因组运输到宿主细胞内。少数病毒与细胞膜直接融合将自身基因组释放至细胞(例如HIV)，而大部分病毒则通过内吞作用进入细胞。由于细胞存在多种内吞途径，每种病毒采用的具体的内吞途径也不尽相同。研究表明，流感病毒侵入细胞是通过HA蛋白与细胞表面的唾液酸受体结合，经过网格蛋白和小窝蛋白介导的侵入途径进入细胞，而Dynamin蛋白是网格蛋白和小窝蛋白介导内吞的关键蛋白。本研究为了研究病毒内吞作用的侵入途径，采用AIV A/duck/Guangxi/35/2001(DK/35)(H5N1)、rDK/35(Q226L/G228S)(H5N1)、rDK35/HA-A160T(H5N1)作为主要研究用毒株，加入Dynamin蛋白的抑制剂Dynasore，通过间接免疫荧光观察病毒侵入情况。结果表明，在胎牛血清存在的情况下，流感病毒能够采用不依赖于Dynamin的侵入方式，即流感病毒能够采用不依赖于网格蛋白和小窝蛋白介导的侵入方式侵入细胞。本研究进一步采用巨胞饮作用抑制剂5-(N-乙基-N-异丙基）阿米洛利EIPA，观察病毒侵入情况，结果表明，巨胞饮作用在不依赖于网格蛋白和小窝蛋白介导的侵入体外培养的细胞中起到一定作用。此外，去除细胞表面的唾液酸受体，观察病毒侵入情况。结果表明，唾液酸受体在病毒不依赖于Dynamin的侵入方式中起着一定作用。同样，采用不同受体结合性病毒感染A549时，巨胞饮作用同样发挥一定作用。在Dynasore存在的情况下，采用DK/35感染DF1、MDCK，结果表明不同种源细胞中，巨胞饮在病毒侵入时发挥一定作用。
　　本实验所验证的巨胞饮在流感病毒侵入细胞时可能发挥的作用，为流感病毒的感染机理的研究提供了实验依据，对于后续的流感病毒的防控提供了一定的思路。

目录

声明

摘要

英文缩略词表

第一章 引言

1．1 A型流感病毒概述

1．2 禽流感病毒概述

1．3 H5N1亚型高致病性禽流感病毒概述

1．4 流感病毒侵入细胞概述

1．4．1 侵入细胞与受体相关

1．4．2 受体介导病毒侵入细胞的方式

1．5 Dynamin概述

1．6 巨胞饮概述

第二章 材料方法

2．1 材料

2．1．1 病毒与细胞

2．1．2 主要试剂

2．1．3 仪器设备

2．2 实验方法

2．2．1 病毒TCID50的测定及纯化

2．2．2 Dynasore实验

2．2．3 抑制剂实验

2．2．4 唾液酸实验

第三章 实验结果

3．1 病毒纯化电镜观察

3．2 Dynasore实验

3．2．1 Dynasore工作浓度的确定

3．2．2 胎牛血清存在情况下的Dynasore实验

3．2．3 A549流式细胞测定

3．2．4 A549、MDCK及DF1细胞的Dynasore实验

3．3 抑制剂实验

3．3．1 EIPA抑制实验

3．3．2 病毒感染细胞定位实验

3．4 唾液酸实验

3．4．1 A549表面SAα-2，3和SAα-2，6受体的分布情况

3．4．2 不同受体结合特性的病毒感染A549的情况

3．4．3 去除唾液酸后Dynasore实验

第四章 讨论

4．1 实验意义

4．2 Dynasore实验

4．2．1 Dynasore抑制作用

4．2．2 血清存在情况下的病毒侵入

4．2．3 EIPA验证

4．2．4 不同受体亲和性病毒感染

4．2．5 血清中的促进因素

4．3 实验操作注意事项

4．3．1 病毒纯化

4．3．2 Dynasore实验

4．3．3 流式细胞实验

第五章 全文结论

参考文献

致谢

作者简历