抗大豆胞囊线虫候选基因的发掘及CAPS标记开发

摘要

大豆胞囊线虫病[Heterodera glycines Ichinohe，Soybean cyst nematode(SCN)]是危害世界大豆(Glycine max L.Merr)生产的主要病害。种植抗病品种是当前防治大豆胞囊线虫病最经济有效的措施。在育种过程中，只有PI88788、Peking和PI437654等SCN抗源被广泛利用，导致生产上应用的抗病品种抗性单一、遗传基础严重狭窄。经典遗传学研究表明，SCN是由主效基因(rhg1和Rhg4)和微效多基因控制的复杂数量性状，聚合多个抗病基因或QTL可显著提高大豆对SCN的抗性。我国是大豆起源地，拥有许多优异的抗源，但其遗传基础尚不清楚，阻碍了优异抗源在育种中的利用。本研究利用关联分析和连锁分析相结合的方法分析我国丰富的抗感资源，对SCN3号生理小种抗性进行精细定位，发掘与抗性相关的优异等位变异，开发简便、经济、可用于辅助选择的分子标记，阐明国内外优异抗源的遗传背景，为培育抗病品种、拓宽大豆育成品种的遗传基础提供标记/基因和材料资源。
　　主要研究成果为:
　　(1)对以我国抗SCN应用核心种质为主的209份抗感资源和242份衍生自中品03-5373和中黄13杂交后代的重组自交系群体在田间和温室进行SCN3号生理小种(SCN3)抗性的多年重复鉴定，结果表明，209份抗感资源的FI变化范围从0到251.34，呈现连续分布，132份种质(63.2％)抗病(FI＜10)，其中大部分(87.9％)为地方品种。中品03-5373表现免疫，中黄13表现高感，RIL中抗性偏分离，28份表现抗病(FI＜10)，而189份表现感病(FI＞60)。
　　(2)利用39个SSR和14个SNP标记对209份大豆抗感资源进行的STRUCTURE和聚类分析表明，该群体内存在明显的群体结构，分为与地理来源相关的2个亚群。结合585个SNP对209份抗感资源的基因型鉴定和SCN3抗性鉴定结果，利用混合线性模型(Mixed liner model，MLM)算法（Q+K模型）检测到与SCN3抗性显著关联的28个数量性状核苷酸(Quantitative traitnucleotide，QTNs)(p＜0.001)，分别解释4.8％到10.6％的抗性变异。其中27个为非同义突变位点，位于23个注释基因内。在Rhg4区间和rhg1-b在Gm11上的同源基因组区段内检测到成簇分布的QTNs。3个关联信号最强的QTNs（Map-5428、Map-5149和Map-5147）分别位于已克隆的主效基因rhg1-b（Glyma18g02590）及rhg1-b同源基因组区段的Glyma11g35820和Glyma11g35810基因。
　　(3)利用1062个分子标记建立了RIL群体的遗传连锁图谱，全长为2990.7 cM，标记间的平均遗传距离为2.97 cM。标记间大于20 cM的遗传空隙为11个，共分离标记为317个，每个位点共分离标记数从2到42不等，平均为4.6个。利用完备区间作图(Inclusive composite intervalmapping，ICIM)方法连锁定位到2个QTL，分别位于上述的rhg1-b位点及其11号染色体上的同源基因组区段，进一步验证了关联分析结果。前者解释了25.5％的表型变异，后者为5.8％，其抗病等位变异皆来自中品03-5373，上位性互作效应值为36.86％，高于rhg1-b位点的加性效应值(28.97％)，说明聚合两个QTL可以增强SCN3抗性。
　　(4)针对上述发掘及已报道的与SCN3抗性相关的SNP位点开发CAPS/dCAPS等简便、易操作的分子标记。其中根据Rhg4(GmSHMT)两个SNP位点开发CAPS标记(Rhg4-389)和dCAPS标记（Rhg4-1165），根据rhg1-b的QTN(Map-5428)开发CAPS标记(rhg1-2590)。利用开发的3个标记及常用于SCN标记辅助选择的SSR标记Satt309对193份以大豆胞囊线虫应用核心种质为主的抗感资源进行基因型鉴定。发现Rhg4-389-G、Rhg4-1165-T和rhg1-2590-G主要存在于抗病种质，Rhg4位点两个标记形成的单倍型对抗病种质鉴定效率达94.1％;rhg1-2590-G对抗病种质的鉴定效率为92.9％。4个标记联合使用，可有效区分供试资源在两个抗病主效位点rhg1-b和Rhg4上的遗传基础，同时发现6份可能携带新抗病基因的种质。

目录

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摘要

英文缩略表

第一章 绪论

1．1 前言

1．2 大豆胞囊线虫

1．2．1 SCN生活史

1．2．2 SCN生理小种的划分和分布

1．2．3 SCN的防治

1．2．4 SCN抗病基因研究进展

1．2．5 SCN分子标记辅助选择及育种

1．3 本研究的目的与意义

第二章 利用关联分析方法发掘SCN抗性位点

2．1 材料与方法

2．1．1 实验材料

2．1．2 大豆全基因组DNA提取

2．1．3 SCN3抗性鉴定

2．1．4 多态性分子标记筛选与SNP芯片开发

2．1．5 数据分析

2．2 结果与分析

2．2．1 SCN3抗性鉴定

2．2．2 标记统计与描述

2．2．3 遗传结构分析

2．2．4 关联分析

2．3 讨论

第三章 利用连锁分析方法发掘SCN抗性位点

3．1 材料与方法

3．1．1 实验材料

3．1．2 多态性分子标记筛选

3．1．3 数据分析

3．2 结果与分析

3．2．1 重组自交系群体SCN3抗性鉴定

3．2．2 遗传连锁图谱构建

3．2．3 连锁分析

3．3 讨论

3．3．1 SCN抗性遗传分析

3．3．2 连锁与关联分析方法比较

第四章 SCN抗性相关标记开发与利用

4．1 前言

4．2 材料与方法

4．2．1 实验材料

4．2．2 抗性相关标记开发

4．2．3 数据的分析方法

4．3 结果与分析

4．3．1 抗源鉴定

4．3．2 CAPS／dCAPS标记开发与验证

4．3．3 抗源基因型鉴定

4．3．4 连锁不平衡分析和单倍型分析

4．4 讨论

第五章 全文结论

参考文献

附录

致谢

作者简历