番茄控制早开花的主效QTL的精细定位

摘要

开花标志着植物从营养生长阶段进入生殖生长阶段，该过程受遗传和环境共同影响。在相同环境条件下，早开花意味着植物能够利用较少的能量进入生殖生长，这对于植物规避恶劣环境（如低温）完成生命周期有重要意义。番茄上，开花时间是一个由多基因控制的数量性状，开花早晚与熟性有较高的相关性。同时，早熟意味着较高的产值。因此，阐明开花时间的遗传基础具有重要意义。本研究以071-440（晚开花，P2）与Bone MM（早开花，P1）两个栽培番茄构建的F2群体为研究对象，利用混合分组(BSA) QTL-Seq技术定位主效QTLs，结合基冈表达分析筛选候选基因，并对两个已报道的miRNA进行了表达模式分析，获得的主要结果如下:
　　1.基于QTL-Seq定位了7个与番茄早开花性状相关的主效QTL。以构建的1200个F2单株为研究对象，选取极端早熟和极端晚熟的各40个单株的DNA等量混合，组成两个子代池，与亲本池共同测序。采用QTL-Seq分析将番茄的早开花性状定位于1号染色体上，其物理区域为1.6Mb-71.8Mb。根据SNP-index的结果，在此区域发现了7个主效QTL位点，分别位于23.5Mb-24Mb、24Mb-28Mb、35Mb-40Mb、52.5Mb-54Mb、59Mb-62Mb、69Mb-72Mb和70Mb-74Mb之间。根据番茄基因组注释的结果，在上述区域预测得到了与早开花性状相关的7个基因，分别为EF1(Solyc01g017060), EF2(Solyc01g018000), EF3(Solyc01g034220), EF4(Solyc01g057370),EF5(Solyc01g058640), EF6(Solyc01g073700)和EF7(Solyc01 g081360)。
　　2.结合传统QTL分析，筛选获得了1个与番茄早开花相关的QTL。根据QTL-Seq分析的结果，在上述7个区域设计了143个Indel标记，随机挑选136个F2单株进行QTL分析。QTL分析结果表明:番茄早开花的QTL位于标记Fl-Indel2和Fl-Indel8之间，对应的物理位置为23.5Mb-25.3Mb。该区域与测序分析预测的23.5Mb-24Mb区间存在较高的一致性，即EF1所在的区域。
　　3.对测序分析预测的7个基因，设计引物，利用实时荧光定量qPCR对7个基因在双亲间的表达进行了研究。结果表明7个基因中EF1在双亲中相对表达量最高，相对表达水平分别为219.34(P1)和73.46(P2)，达到显著差异水平(P≤0.05)。因此EF1可能参与了番茄开花时间的调控。经BLAST分析，该基因与番茄的Ycf2基因相似度较高。
　　4.研究了miR156和miR172在番茄不同叶位（从下部向上，依次为第1，3，4，6，9，12片叶）的表达模式。结果显示，miR156和miR172在P1（早开花）中的表达随叶位增加表达量增加，均在第12片急剧升高，达到最高值，分别为1.12倍和4.88倍，而P1的始花节位为第6片叶。这两个miRNA在P2（第12片叶始花）中的表达存在差异，miR156在第3片叶时相对表达量最高（2.18倍），miR172在第9片叶时相对表达量最高（62.12倍），第12片叶时表达量下降。因此，这两个miRNA的表达与早开花没有必然的联系。

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摘要

Abstract

CONTENTS

Abbreviations

CHAPTER Ⅰ INTRODUCTION

1．1 Flowering

1．2 Transition to flowering

1．2．1 The role of miRNA156(miR156)in transition to flowering

1．2．2 The role of miRNA172(miR172)in transition to flowering

1．3 The mieroRNAs(miRNAs)in flowering time

1．3．1 The miRNA159(miR159)family

1．3．2 The miRNA319(miR319)family

1．3．3 The miRNA390(miR390)family

1．3．4 The miRNA399(miR399)family

1．4 Proteasomes related flowering time

1．4．1 The 26s proteasome

1．4．2 Proteasomal regulation of plant growth

1．5 Chloroplast Ycf2 related in flowering time

1．6 The earliness trait in breeding

1．7 Quantitative Trait Locus(QTL)

1．8 Candidate genes

1．9 QTL gene confirmation

1．10 Molecular marker

1．11 The nature of QTL variation

1．12 QTL mapping

1．12．1 MutMap method

1．12．2 QTL-seq method

1．12．3 MutMap+ method

1．13 Objectives

CHAPTER Ⅱ QTL-seq analysis of early flowering in tomato

2．1 Materials and methods

2．1．1 Plant materials and phenotypic evaluation

2．1．2 Genomic DNA extraction

2．1．3 QTL-seq analysis

2．2 Results

2．2．1 Distribution of early flowering time in F2 population

2．2．2 Sequencing data evaluation

2．2．3 Sequencing data evaluation of early flowering trait

2．2．4 Alignment analysis of sequencing data

2．2．5 SNP detection and annotation

2．2．6 Region location of the SNPs annotation

2．2．7 Genomic region responsible for the early flowering phenotype

CHAPTER Ⅲ Traditional QTL analysis for QTL-seq confirmation

3．1 Materials and methods

3．1．1 Plant materials

3．1．2 DNA extraction

3．1．3 Insert or deletion(InDel)markers performance

3．1．4 Quantitative trait loci(QTL)analysis

3．2 Results

CHAPTER Ⅳ Gene expression analysis of candidate genes

4．1 Materials and Methods

4．1．1 Plant material

4．1．2 Totai RNA extraction

4．1．3 Checking the quality of total RNA on agarose gel

4．1．4 Single-strand cDNA synthesis

4．1．5 RT-qPCR performance

4．2 Results

CHAPTER Ⅴ The expression of miR156 and miR172 early and late tomatoes and F1 progeny

5．1 Materials and Methods

5．1．1 Plant materials

5．1．2 Total RNA extraction

5．1．3 Checking the quality of total RNA on agarose gel

5．1．4 Single-strand cDNA synthesis

5．1．5 RT-qPCR performance

5．2 Results

5．2．1 General physiology of earliness，lateness and F1 progeny

5．2．2 Measuring of miR156 and miRl72 expression of P1，P2 and F1

CHAPTER Ⅵ CONCLUSIONS AND DISCUSSION

REFERENCES

ACKNOWLEDGEMENTS

CURRICULUM VITAE