复合Bt crylAc和crylIe抗虫玉米抗螟性及其在IRM中的作用

摘要

亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis(Guenée)是我国玉米上的重要害虫之一。分子生物学的发展与基因工程技术的应用，使能够高效控制靶标害虫的Bt作物得到推广。但大面积种植转单一Bt基因作物可引发靶标害虫产生抗性，避免和延缓抗性是保障转基因抗虫作物持续应用所面临的一项巨大挑战。“多基因”策略能有效延缓抗性产生，且更适宜于小农户种植模式，但要求所表达的毒素间不存在交互抗性或交互抗性很低。本研究通过田间抗螟性鉴定、组织生测、Elisa等方法，系统评价了cry1Ac/cry1 Ie双价抗虫基因玉米组织蛋白表达量，田间抗虫效果，室内对于亚洲玉米螟敏感品系ACB-BtS和以Cry1Ac、Cry1Ie、Cry1F分别连续筛选多代的抗性品系ACB-AcR、ACB-IeR、ACB-FR的杀虫活性及其在抗性治理中的应用潜力，并结合不同配比的蛋白浓度毒力生测，模拟蛋白在组织中的表达，探索其功能和规律，以期为抗性治理和新基因的挖掘及应用提供依据。另外将同样具有我国自主知识产权的转有耐除草剂epsps基因和Bt cry1Ac基因的双抗玉米进行对除草剂耐受性及目标蛋白表达量的研究。获得的主要结论如下:
　　心叶期接虫后转基因玉米的食叶级别1-2级，而对照5-8级，差异显著。转基因玉米平均每株活虫数＜0.11头、蛀孔数＜0.59个、隧道长度＜1.06 cm。单价和双价抗虫玉米抗虫效果差异不显著。组织生测表明，玉米螟敏感品系取食不同组织时，转基因和非转基因玉米品种间都存在显著差异，取食花丝的死亡率较低，取食转复合基因玉米雄穗的死亡率较高。ACB-IeR在转单价cry1Ie基因的玉米中死亡率较低，ACB-AcR在转单价cry1Ac基因的玉米中死亡率较低，ACB-FR在转单价cry1Ac基因的玉米中死亡率也较低，这可能是由于Cry1F毒素和Cry1Ac毒素具有一定的交互抗性，而这几个抗性种群在转双价基因的玉米中死亡率都较高，与敏感种群相近，说明转复合基因玉米对抗性种群有较好的杀虫效果。蛋白毒力生测表明，Cry1Ac和Cry1Ie在浓度配比为1∶5时对ACB-AcR不具增效作用。对草甘膦的耐受性实验表明，转复合基因玉米CC-2×BT799与单抗草甘膦品种CC-2对草甘膦均具有良好的耐受性。心叶期喷施草甘膦推荐施用剂量中量和2倍剂量对其株高和后期生长发育无不良影响。Elisa检测显示，CP4EPSPS蛋白在雄穗中的表达较叶片稍高。且双抗品种较CC-2中的CP4 EPSPS蛋白含量稍高。在雄穗中，BT799的Cry1Ac蛋白含量与CC-2×BT799相当。在叶片中，Bt799的Cry1Ac蛋白含量约为CC-2×Bt799的2倍。抗虫耐除草剂玉米能够有效抵御草甘膦的喷施，Cry1Ac蛋白含量在不同品种不同组织中存在差异。
　　结果表明，4种转基因玉米都具有较好的抗虫效果。不同组织而言，花丝的抗虫效果较差。蛋白毒力生测表明不同配比对不同抗性品系具有或强或弱的增效作用。在亚洲玉米螟敏感品系中，Cry1Ac和Cry1Ie毒素配比为5∶1时效果最佳，说明二者的结合更有利于靶标害虫的防治。对草甘膦的耐受性实验表明，转复合基因玉米CC-2×BT799与单抗草甘膦品种CC-2对草甘膦均具有良好的耐受性。心叶期喷施草甘膦正常剂量和2倍剂量对其株高和后期生长发育无不良影响。

目录

声明

摘要

第一章 引言

1．1 转Bt基因玉米的研究现状

1．2 Bt蛋白的作用机理

1．3 昆虫对Bt毒素的抗性

1．3．1 抗性机理

1．3．2 昆虫对Bt作物抗性的研究

1．4 抗性治理策略的应用

1．4．1 “高剂量庇护所”策略的应用

1．4．2 多基因策略

1．5 混合Bt蛋白对抗性治理的作用

1．5．1 混合Bt蛋白的增效作用

1．5．2 混合Bt蛋白的增效作用机理

1．6 转复合Bt基因玉米的应用

1．7 本研究的目的与意义

第二章 转双价抗虫基因玉米田间抗虫性评价

2．1 材料与方法

2．1．1 供试玉米

2．1．2 种植方法

2．1．3 供试昆虫

2．1．4 田间抗虫性鉴定

2．1．5 试验设计与数据统计分析

2．2 结果与分析

2．2．1 心叶期抗螟性

2．2．2 穗期抗螟性

2．3 讨论

第三章 转基因玉米不同组织对亚洲玉米螟抗性品系生测

3．1 材料与方法

3．1．1 供试昆虫

3．1．2 供试玉米组织

3．1．3 组织生测

3．1．4 数据处理

3．2 结果与分析

3．3 讨论

第四章 转基因玉米Cry1Ac蛋白表达量测定

4．1 材料与方法

4．1．1 供试玉米

4．1．2 主要试剂

4．1．3 主要仪器

4．1．4 Cry1Ac蛋白表达量测定

4．1．5 数据处理

4．2 结果与分析

4．3 讨论

第五章 Cry1Ac／Cry1Ie蛋白对亚洲玉米螟抗性品系增效作用

5．1 材料与方法

5．1．1 供试昆虫

5．1．2 供试Bt毒素蛋白

5．1．3 毒力生测

5．1．4 数据统计与分析

5．2 结果与分析

5．3 讨论

第六章 转基因抗虫耐除草剂玉米对草甘膦耐受性研究

6．1 材料与方法

6．1．1 供试玉米

6．1．2 供试除草剂

6．1．3 CP4 EPSPS和Cry1Ac蛋白表达量测定

6．1．4 草甘膦耐受性试验

6．1．5 实验设计与数据分析

6．2 结果与分析

6．2．1 转基因玉米CP4 EPSPS和Cry1Ac蛋白表达量

6．2．2 转基因玉米对草甘膦的耐受程度

6．3 讨论

第七章 结论

参考文献

致谢

作者简历