梅花鹿致敏与休眠鹿茸干细胞差异表达蛋白的2D-DIGE分析

摘要

鹿茸是目前已知的唯一一个可周期性再生的哺乳动物附属器官，实验证明是角柄骨膜中的角柄骨膜细胞具有完全再生出鹿茸组织的能力。根据与皮肤接触紧密程度的不同，角柄骨膜可以分为致敏区与休眠区，前者与其皮肤的相互作用能使角柄致敏，最终使角柄骨膜细胞，即鹿茸干细胞，发育成鹿茸组织。因此，角柄骨膜干细胞中的蛋白质组的变化可能在触发鹿茸再生的过程中扮演了主要角色。以往，对角柄骨膜致敏区与休眠区（尚未与覆盖皮肤建立相互作用）的研究以定性蛋白质组学技术为主，如双向电泳技术；而通过定量蛋白质组学技术对此方面进行的研究尚未见诸报道。
　　本研究首先将梅花鹿(Cervus nippon)角柄骨膜细胞作为试验材料，从细胞破碎方法、染色方法、等电聚焦(Isoelectric Focusing, IEF)总伏小时数(volt-hours)和蛋白提取纯化组合4个不同的角度来优化双向电泳过程，为后续基于双向电泳原理的荧光差异显示双向电泳技术(Two-dimensional Fluorescence Difference in Gel Electrophoresis,2D-DIGE)所进行的致敏与休眠鹿茸干细胞差异蛋白质组学研究提供借鉴依据。结果显示：与超声相比，Bullet Blender对于细胞样品的破碎效果更好；双染法能够得到更多且更清晰的蛋白点；IEF总伏小时数为15000时所得到的凝胶图谱最适合于后续软件分析；通过对6种蛋白提取与纯化组合的比较来看，自制裂解液与2D Clean-up Kit处理可以得到更清晰且具有更多蛋白丰度信息的凝胶图谱。
　　随后采用荧光差异显示双向电泳技术分离蛋白样品；利用DeCyder2D7.2分析软件对2D-DIGE所得到的凝胶图谱进行统计分析以寻找致敏与休眠鹿茸干细胞的差异表达蛋白；MALDI-TOF-MS(Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry)鉴定差异蛋白，通过Mascot软件搜索NCBInr数据库寻找匹配蛋白；采用PANTHER软件对差异蛋白进行聚类分析，REACTOME数据库分析差异蛋白所参与的信号通路。结果显示：在致敏鹿茸干细胞与休眠鹿茸干细胞蛋白丰度的比较中，共159个蛋白点比值≥1.1倍或≤-1.1倍(p＜0.05)，在这些差异蛋白点中，110个差异点上调表达，而其余49个差异点下调表达。质谱鉴定了84个差异蛋白点，其中48个为阳性结果，它们来自27种蛋白质。并对已鉴定到的蛋白进行了GO分析和信号通路富集等一系列生物信息学分析。
　　通过对质谱数据的归纳分析后发现：POTE ankyrin domain family member E、SUMO-activating enzyme subunit1、Aldolase B、Glucose-regulated peptide78、Inositol1,4,5-trisphosphate receptor type1、Tetratricopeptide repeat protein36、Histone H4、ATP synthase subunit beta和Vimentin等九种蛋白可能与触发鹿茸再生有密切的关系。其中,后四种蛋白是 DeCyder2D7.2分析软件所判定的Marker蛋白，这些蛋白可能是决定致敏与休眠鹿茸干细胞再生功能有无的重要调控蛋白。综上可知，鹿茸再生是鹿茸干细胞从休眠到致敏的转化过程，需要多种蛋白分子以及信号通路的综合调控。本研究为深入探讨鹿茸所具有的独特再生分子调控机制提供了理论依据。

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英文缩略表

第一章 引 言

1.1 鹿茸概述

1.2 鹿茸生物学

1.2.1 鹿茸的再生基于干细胞

1.2.2 角柄骨膜致敏区与休眠区

1.3 鹿茸蛋白质组学研究进展

1.3.1 基于凝胶系统的鹿茸蛋白质组学研究

1.3.2 基于非凝胶系统的鹿茸蛋白质组学研究

1.4 问题与展望

1.5 研究内容、目的和意义

第二章 梅花鹿角柄骨膜细胞蛋白质组双向电泳条件优化

2.1 材料与方法

2.1.1 试验材料

2.1.2 试剂

2.1.3 主要仪器

2.1.4 试验步骤

2.2 结果与分析

2.2.1 细胞蛋白制备方法与染色方法的优化

2.2.2 等电聚焦条件的优化

2.2.3 蛋白样品处理方式的优化

2.3 讨论

第三章 致敏与休眠鹿茸干细胞差异表达蛋白的2D-DIGE分析

3.1 材料与方法

3.1.1 试验材料

3.1.2 试剂

3.1.3 主要仪器

3.1.4 试验步骤

3.2 结果与分析

3.2.1 2D-DIGE预试验

3.2.2 致敏鹿茸干细胞与休眠鹿茸干细胞蛋白表达差异分析

3.2.3 差异表达蛋白MALDI-TOF-MS 鉴定

3.2.4 差异表达蛋白的生物信息学分析

3.3 讨论

3.3.1 质谱鉴定中部分多点重复蛋白与鹿茸再生的关系

3.3.2 生物信息学分析已鉴定的差异表达蛋白与鹿茸再生的关系

3.3.3 2D-DIGE图谱EDA判定的Marker与鹿茸再生的关系

3.3.4 本章研究蛋白鉴定结果的不足

第四章 结 论

参考文献

附录

致谢

作者简历