水稻蜡质合成代谢基因WSL3及WSL4的克隆和功能分析

摘要

陆地植物表面覆盖着一层蜡质层，蜡质作为植物表面与环境之间的第一层屏障，具有重要的功能。蜡质能防止植物水分的流失，能屏蔽过量的紫外线，能形成自洁式的表面抵御外来的灰尘，能作为物理屏障来抵挡害虫和病原菌的侵害，还能在器官边界确定上起到重要的作用。水稻作为重要的模式作物，对水稻蜡质控制基因进行研究，进而利用其改良水稻的抗逆能力，具有重要的意义。本文以两个水稻叶片蜡质减少突变体Wax crystal-sparse leaf3(wsl3)和Wax crystal-sparse leaf4(wsl4)为材料，在表型鉴定的基础上，利用图位克隆技术对目标基因进行了分离，进一步对其功能进行了初步的研究，主要内容如下：
　　1.蜡质突变体wsl3和wsl4的表型分析
　　通过对日本晴组培突变体库的筛选，获得了水稻叶片蜡质减少的突变体wsl3和 wsl4。两个突变体均呈现叶片沾水的表型，且wsl4突变体比野生型株高略矮，分蘖数减少。透射电镜(TEM)观察发现wsl3和wsl4突变体叶片表皮增厚。扫描电镜(SEM)观察发现突变体叶片表面蜡质晶体显著性降低。GC-MS测定发现尽管突变体叶片表面角质含量与野生型相当，但是，突变体叶片表面蜡质各成分含量相对于野生型则显著性下降。生理学实验表明，wsl3和wsl4突变体的细胞膜通透性都有一定程度的升高。
　　2.蜡质代谢合成基因WSL3和WSL4的图位克隆和功能验证
　　利用图位克隆技术，我们将WSL3定位于4号染色体InDel标记M-2396和M-2404之间83 kb区间内，对该区间的基因测序发现LOC_Os04g40730第一个外显子的736和737的两个连续的碱基GC突变为TT，导致了所编码的蛋白质第207位的氨基酸由丙氨酸突变为苯丙氨酸。WSL4基因定位于3号染色体InDel标记M-6283和M-6341的58 kb区间内，对该区间基因测序发现Loc_Os03g12030基因的1281位的碱基由G突变为A，位于第二个外显子上，导致了所编码的蛋白质第312位的氨基酸由缬氨酸突变为甲硫氨酸。生物信息学分析结果表明LOC_Os04g40730和Loc_Os03g12030分别编码KCR和KCS类蛋白，都是蜡质合成途径的基因。进一步的遗传互补和RNAi干扰实验表明这两个基因即为目标基因。
　　3.WSL3和WSL4基因的时空表达分析及亚细胞定位
　　利用实时荧光定量RT-PCR和GUS表达实验对WSL3和WSL4两个基因的表达模式进行了分析。结果表明，WSL3和WSL4在根、茎、叶、花等各个组织中均有表达，属于组成型表达基因。构建WSL3和WSL4基因的亚细胞定位GFP载体，在烟草中瞬时表达，发现它们都能与ER marker共定位，表明WSL3和 WSL4蛋白都定位于内质网上。
　　4.WSL3蛋白具有脂肪酸延长酶活性
　　在酵母ybr159wΔ突变体中异源表达水稻的WSL3基因，其生长缺陷的表型能得到恢复。当WSL3基因与拟南芥的FAE1基因在ybr159wΔ突变体中共表达的时候，能在酵母ybr159wΔ突变体检测到20:0,22:0,20:1Δ11以及22:1Δ13四种脂肪酸产物，这些结果表明 WSL3具有 KCR酶的脂肪酸延长酶活性。

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第一章 文献综述

1.1 蜡质的合成代谢

1.2 蜡质的转运和分泌

1.3 蜡质代谢的调控

1.4 拟南芥及主要作物中已克隆的蜡质相关基因

1.5 本研究的目的意义

第二章 水稻蜡质缺陷突变体wsl3的表型鉴定及精细定位

2.1 材料与方法

2.2 结果与分析

2.3 讨论

第三章 水稻蜡质基因WSL3的克隆和功能分析

3.1 材料与方法

3.2 结果与分析

3.3 讨论

第四章 水稻蜡质缺陷突变体wsl4的表型鉴定及精细定位

4.1 材料与方法

4.2 结果与分析

4.3 讨论

第五章 水稻蜡质基因WSL4的克隆和功能分析

5.1 材料和方法

5.2 结果与分析

5.3 讨论

第六章 全文总结

6.1 wsl3和wsl4突变体的蜡质积累异常

6.2 WSL3和WSL4基因编码FAE复合体蛋白，参与了超长链脂肪酸的延伸

6.3 WSL3和WSL4组成型表达且定位于内质网中

6.4 WSL3具有脂肪酸延伸酶活性

参考文献

附录

致谢

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