小麦穗发育相关基因TaSPL20的生物学功能分析

摘要

小麦(Triticum aestivumL.)是世界的重要粮食作物，提高小麦产量是育种家的主要目标之一。小麦穗部和籽粒的发育对产量形成起到至关重要的作用。因此，挖掘小麦穗部和籽粒发育的基因资源并揭示其作用机理，对于进一步认识小麦产量性状的遗传基础和改良产量具有重要的理论意义和实际应用价值。SBP-box(Squamosa-promoter binding protein)基因家族编码绿色植物特有的一类转录因子，广泛参与植物的生长发育、形态建成和各种信号的转导过程。SPL(Squamosa-promoter binding protein-like)是SBP-box基因家族的成员。为揭示小麦TaSPL基因与穗部和籽粒发育的关系，本研究以课题组前期克隆到的小麦TaSPL基因为基础，选取在穗部和顶尖分生组织特异表达的TaSPL20基因为研究对象，从小麦的三个基因组中克隆了TaSPL20基因的不同成员，通过对基因在小麦穗部的表达分析、关联分析和转基因水稻的表型鉴定等，明确了TaSPL20对小麦穗部和籽粒发育的作用。主要研究结果如下：
　　1．克隆了小麦TaSPL20-A、TaSPL20-B和TaSPL20-D基因组序列，其全长依次为4690 bp、2720 bp和4740 bp。利用中国春缺-四体材料将TaSPL20-A、TaSPL20-B和TaSPL20-D分别定位于小麦第七染色体同源群的7A、7B和7D；利用RIL群体将TaSPL20-A定位在染色体7A，位于标记Xrz682-7A和Xfbb145-7A之间，遗传距离分别为8.41 cM和4.09 cM。
　　2． TaSPL20-D响应侧芽发育激素，但应答模式不同。其中，IAA、6-BA和 GA3处理小麦幼苗后，TaSPL20-D首先呈现下调表达，GR24处理后首先出现上调表达。TaSPL20-D在小麦幼穗的内稃、外稃和雌蕊中大量表达。TaSPL20-D蛋白的碳端具有转录激活活性，而氮端和中间SBP结构域对碳端的激活活性有抑制作用。
　　3．在TaSPL20-A基因序列中检测到8个多态性位点，将其划分为三种单倍型Hap1-A、Hap2-A和Hap3-A，开发了CAPS标记CAPS-20A，可以区分不同单倍型；没有检测到TaSPL20-B的多态性位点；TaSPL20-D启动子区存在2个SNP位点，组成单倍型Hap1-D、Hap2-D和Hap3-D。
　　4．小麦TaSPL20基因单倍型与表型性状的关联分析结果显示，TaSPL20-A的单倍型Hap3-A能提高每穗小穗数。TaSPL20-D的单倍型与千粒重和株高关联，其中 Hap1-D是增加千粒重、降低株高的优异单倍型。对我国不同年代育成品种的分析显示，TaSPL20-A和TaSPL20-D的单倍型受到了育种家的选择。单倍型在中国十大麦区的分布情况表明，Hap1-A和Hap1-D在现代育成品种中的应用范围显著扩大，频率提高，并且仍然有较大的提升应用潜力。
　　5．转基因水稻的表型鉴定结果显示，过表达TaSPL20-D影响水稻幼苗的株型，但不会显著改变成株期的株型；过表达TaSPL20-D水稻的穗长、穗分枝数、穗粒数、粒长、粒宽、千粒重及空粒数显著增加，个别株系的株高降低，但单株产量没有产生显著变化。

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第一章 引 言

1.1 禾本科作物产量相关性状的遗传研究

1.1.1 禾本科作物分蘖性状

1.1.2 禾本科作物穗部性状

1.1.3 禾本科作物籽粒性状

1.2 SBP-box基因研究进展

1.2.1 SBP-box基因家族

1.2.2 小麦SBP-box基因

1.3 单核苷酸多态性

1.3.1 单核苷酸多态性检测方法

1.3.2 SNP的应用

1.4 单倍型与关联分析

1.4.1 单倍型与SNP

1.4.2 关联分析的概念

1.4.3 关联分析的方法

1.5 本研究的目的意义及技术路线

1.5.1 本研究的目的意义

1.5.2 本研究的技术路线

第二章 TaSPL20-A单倍型与产量性状的关联分析

2.1 实验材料和方法

2.1.1 植物材料

2.1.2 实验试剂、酶和引物

2.1.3 载体与菌株

2.1.4 小麦基因组DNA的提取

2.1.5 TaSPL20-A的基因组克隆

2.1.6 TaSPL20-A序列核苷酸多态性的检测

2.1.7 TaSPL20-A分子标记设计

2.1.8 TaSPL20-A的遗传定位

2.1.9 数据的统计与分析

2.2 结果与分析

2.2.1 TaSPL20-A基因的克隆及染色体定位

2.2.2 TaSPL20-A的标记开发及遗传定位

2.2.3 TaSPL20-A单倍型与产量相关性状的关联分析

2.2.4 20A-SNP1和20A-SNP6与小麦产量的相关性状的关联分析

2.2.5 TaSPL20-A单倍型在不同年代育成品种中的分布

2.2.6 TaSPL20-A不同单倍型在中国主要麦区的分布

第三章 TaSPL20-D的生物学功能分析

3.1 实验材料与方法

3.1.1 植物材料

3.1.2 实验试剂、酶和引物

3.1.3 载体与菌株

3.1.4 植物总RNA提取

3.1.5 RNA反转录

3.1.6 目标基因的表达分析

3.1.7 TaSPL20-D转录激活和酵母文库筛选

3.1.8 转基因水稻的性状分析

3.1.9 TaSPL20-D单倍型与表型性状的关联分析

3.1.10 数据统计分析

3.2 结果与分析

3.2.1 TaSPL20-D基因的克隆及序列分析

3.2.2 TaSPL20-B和TaSPL20-D的染色体定位

3.2.3 TaSPL20-D响应侧生发育相关激素

3.2.4 TaSPL20-D在小麦穗部的时空表达模式

3.2.5 TaSPL20-D转录激活活性检测

3.2.6 TaSPL20-D转基因水稻表型鉴定

3.2.7 TaSPL20-D的关联分析

第四章 讨 论

4.1 TaSPL20序列分析

4.2 TaSPL20-D的表达模式

4.3 TaSPL20的生物学功能

第五章 全文结论

参考文献

致谢

作者简历